四川大华西医院检验科 彭黎明 扬佳荟

 关键词：外周血干细胞；定量分析 

外周血干细胞（peripheral blood stem cell,PBSC）,已在很大程度上代替骨髓作为自体移植的最主要干细胞来源，且逐步应用于HLA相合的胞史妹之间异体移植。外周血干细胞移植（PBSC transplantation, PBSCT）的优势包括：（1）造血功能的快速恢复；（2）减少肿瘤细胞污染；（3）降低病人费用；（4）增加移植物中T细胞和NK细胞数量，产生移植物抗白血病效应(GvL),降低移植后复发；（5）避免麻醉和手术等。同时PBSC的产物更适于体外调控，如CD34+细胞的筛选、肿瘤细胞的清除和基因移植。

PBSCT的关键因素为确定移植所需  PBSC的最采集PBSC的最佳时机。但结论并不肯定，其中主要的原因为氛乏准确定量PBSC的方法。目前，检测PBSC的方法主要有4种：（1）集落培养法；（2）流式细胞仪分析CD34+细胞；（3）全自动血细胞分析法；（4）分子生物学法。现对各方法理、分析特性、用途及其相互关系的进展予以简述。

一、集落培养法检测粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）

集落培养法是指对外周血中单个核细胞（PBMNC）进行体外培养，2周后观察CFU-GM数目，以间接反映PBSC数。对PBSCT所需的CFU-GM数量有不同报道，即（15-50）×104CFU-GM/Kg体重。如此大量的造血祖细胞（HPC），可在病人经化疗，血象开始恢复后，每天2-5次，连续2-5d进行白细胞过滤而获得。尤其在化疗后给予人类重组粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF），病人外周血中可出现HPC的暴发增殖。此时，可利用集落培养法检测CFU-GM。检测时，通常以肝素抗凝血经离心或溶血去除红细胞，得白细胞富集液，或经白细胞过滤器得到PBMNC采集液，以（2-4）×104个细胞/ml一式3份移入含有各种营养成分和CSF的半固体培养基进行培养。经37℃、5%CO2、95%湿度条件下温育14d，用倒置显微镜观察CFU-GM（定义为≥50个细胞/集落），用CFU-GM百分数乘以标本中细胞总数即为外周血中的CFU-GM数。Siena等对未治疗的实体瘤病人外周血集落培养法进行重复性研究发现，含有50-150个集落的变异系统(CV)为1%-30%，而大于150个或小于50个集落的CV可超过30%。

尽管集落培养法开展最早，不可直观计数，但共无法定量计数  PBSC。而且，由于方法的复杂性和不规范性，包括使用许多生物试剂，主观性地判断结果（如利用显微镜计数CFU-GM）以及缺乏标准化操作规程等，致使不同实验室得到的CFU-GM结果差异很大，故其只能作为骨髓功能恢复所需细胞数的大致估计。此外，集落培养法主要检测的是分化较为成熟的祖细胞，即粒-巨噬细胞系，而对更为接近PBCS的细胞，如长期培养起始细胞（LTC-IC）和延长LTC-IC（ELTC-IC）则无法分析。尽管目前采用体外培养法能对上述两类细胞进行检测，但其为半定量，方法复杂，耗时长（至少需5周），无法指导临床采集暴发增殖的PBSC。因此，集落培养法只适用于标本的回顾性分析。

二、流式细胞术（flowcytometry , FCM）检测CD34+细胞

目前，FCM是定量周血中HPC的参考方法，广泛应用于外周血干细胞移植实验室，用于决定PBSC采集的时机及评价外周血采集液的收益。其基本原理为荧光免疫分析，即根据外周血与骨髓中HPC表达同样的CD34抗原(CD34+)，并利用荧光标记CD34抗体与HPC膜博面CD34抗原结合，在特定波长的激光照射下，胞发出的荧光强度并结合其光学特性，即较低的侧向散射（SSC）和较高的前向散射（FSC），从而检测CD34+细胞。CD34+细胞实际上包括所有的HPC，如CFU-GM，红细胞暴发形成单位(BFU-E),巨核细胞形成单位（CFU-Mk）,混合细胞集落形成单位（CFU-Mix）和原始细胞集落形成单位（CFU-Blast）。后两种HPC明显具有许多干细胞的特征，如它们可以自我更新，也可定向分化为一定数目的造血细胞系。体内试验也发现，经过致死剂量照射的狒狒移植足够数量的自体CD34+细胞，可以完全恢复其造血功能，同样的现象也可在经过骨央、须摧毁性治疗的病人中出现。有人认为，CD34+细胞在功能上可根据是否表达CD33抗原而分为2个细胞群。早期的HPC，如CFU-Blast和LTC-IC仅表达Q CD34抗原（CD34+/CD33-），而较为成熟的定向祖细胞可同时表达CD34和CD33抗原（CD34+/CD33+）。还有人根据CD38抗原表达与否，将CD34+细胞分为CD34+/CD38-和CD34+/CD38+两个亚型，并且认为LTC-IC主要分布于CD34+/CD38-亚型，而更为原始的ELTC-IC则仅分布于CD34+/CD28-细胞群，说明CD34+/CD38-亚型性质上更接近PBSC。

回顾性资料表面，移植经历了与移植物中不同分化程茺的HPC有关的两个阶段。起初，与早期造血恢复有关的是移植 物中定向祖 细胞（committed progenitor cell）；继之，持续性的移植相由多能造血干细胞产生。因此，周血中不同分化程度的HPC，对指导干细胞采集及移植成功尤为必要。目前多参数及双参数流式细胞低度均可通CD34、CD33和CD38抗体等检测标本中不同CD34+细胞亚型，来决定采血的时机和预测移植效果。Barnett等报道，采集液CD34+细胞数量与外周血中CD34+细胞百分率显著相关（r=0.71），并且认为准确计数循环中CD34+细胞，可更好地预测采集液中造血干/祖细胞含量。Weaver等观察692例患者外周血祖细胞（PBPC）采集液中CD34+细胞、单个核细胞、集落形成单位的数量与移植动力学关系，认为PBPC采集液中CD34+细胞含量是预移植后中性粒细胞和血小板数量回升最有力的指标。

虽然，FCM测定CD34+细胞是检测HPC数量的参考方法，但仍有一些技术问题有待解决：（1）单平台分析代替传统双平台分析的可行性；（2）应对单平台FCM公析实验室进行多中心的横向研究；（3）标本制备方法；（4）确定引起移植后快速和长期造血功能恢复的不同干细胞亚型及移植所需数目等。此外，FCM法需特殊仪器，操作技术要求高，价格昂贵，结果的重复性欠佳，促使人们追求更经济、快捷、简便的方法。

三、血细胞计数仪检测幼稚细胞、HPC

血细胞计数仪（如Sysmex公司的SE-9500）利用幼稚细胞（immature myeloid information, IMI）通道，检测外周血中的幼稚细胞（即IMI+细胞）及HPC，最近年来发展起来的一门新技术。检测原理：同时加入破坏红细胞、血小板的阴离子表面活性剂和作用于白细胞的溶血剂，后者主要与膜脂质成分结合而破坏白细胞。成熟白细胞因膜脂质含量大大高于幼稚细胞，易被溶解；而幼稚细胞由于膜脂质成分含量低而被保留。在IMI通道中，SE-9500利用高频射线（RF）和直流电磁波（DC）对细胞进行分析。其中，RF检测细胞的内容物，如胞核的大小、颗粒的多少等，DC反映细胞的大小或体积。通常，细胞越不成熟，RF越弱，因此IMI+细胞、HPC常出现在IMI散点图的最下方。

Pollard等通过对SE-9500各项参数进行评价，认为该义器有以下特点：（1）CV小：低水平HPC时（4.7×106/L）,CV为3.8%，随着HPC计数逐渐升高（HPC为84.6×106/L），CV降为9.8%。考虑到HPC在外周血中含量很低（0.01%-0.54%），认为该精密度与标准方法FCM计数CD34+细胞相比是可行的。（2）线性好：SE-9500的检测线性约为（0-100）×106/L。（3）携带污染率低:iv HPC含量达500×106/L时，仍无携带污染率。（4）与FCM血CD34+细胞的相关性欠佳：相关系统（r=0.556）。Pol-lard等还发还SE-9500测定的HPC数，通常比检测CD34+细胞高2-3倍，其且某些患者CD34+细胞数反而超过HPC计数。随后，以去除CD34+细胞的全血计数HPC，发现其值并不显著降低；当用免疫磁珠法纯化的CD34+细胞进行HPC测定，其值并没有守全分布在HPC区域。以上结果提示，HPC和CD34+细胞分析，分别检测了不同的祖细胞群，HPC检测的可能是更为成熟的祖细胞。由于目前使用IMI通道是基于区域设定，包括核左移的杆状细胞、原始和幼稚细胞区，一些IMI+细胞阳性率为CD34+细胞百分率相关性差的病例，可能就是由于核左移所引起。因此，当外周血中存在幼稚白血病细胞，包括幼粒细胞时，可干扰HPC测定。但在没有幼稚白血病细胞存在时，如同种异体外周血干细胞移植（Allo-PBSCT），选择正常人作供体，此时分析HPC意义较大，可对采集HPC的最佳时机提供较佳而且简便的方法。

四、分子生物学方法分析CD34 mRNA

目前，主要有2种方法，即：实时反转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）和单个细胞反转录PCR（single-cell RT-PCR）。实时RT-PCR利用带有荧光的TaqMan探针和可实时检测荧光的仪器，如ABI Prism 7700序列检测系统，来进行动态检测。实时RT-PCR可根据CD34 mRNA的不同剪接方式定量分析完整型CD34（CD34F）和截短型CD34+（CD34T）mRNA。实时RT-PCR检测特点为：扩增反应仍处于对数增长期时，进行实时检测。由于该期无反应成分之间的干扰，故cDNA定量的精密度大为提高。而且实时RT-PCR无需对PCR反应产物予以处理，因此可减少PCR产物的携带污染，同时其检测范围更宽，速度更快。

单细胞RT-PCR则联合应用RT-PCR和流式细胞术定量检测CD34 Mrna,是鉴定、分离和检测含量很少细胞的突破性方法。原理为：首先用流式细胞仪单细胞分选技术分离CD34+细胞，再利用RT-PCR技术对该细胞进行CD34特异性转录子的分选和鉴别。通常基于ingle-hitpoisson模型，对含量极低的目的DNA采用有限稀释和全或无PCR反应模式来定量PCR扩增前的目的基因总数。该方法对流式细胞术分选单个细胞技术要求十分高，必须利用来自一个基因的CD34 PCR产物作为分选操作时的阳性对照。

值得注意的是，膜表面分子CD34的半衰期比CD34 mRNA长得多，事实上，仅有0%的CD34+细胞具有活跃的CD34基因转录。而且，根据该模型，在CD34+/CD38-细胞亚型（推测为未定向祖细胞）100%表面CD34 mRNA转录子，而在CD34+/CD38+亚型（推测为定向祖细胞）表达则大为降低。此结果可部分解释为何移植物中虽含有相同的CD34+细胞数，但移植交果却不同的现象。Baech等认为分子生物学检测CD34 mRMA方法灵敏、准确、快速，具有临床和科研推广价值，将会在干细胞移植中为临床提供不同祖细胞亚群的更为准确的数量。

目前，分析外周血干细胞4种方法各有特点（见表1）。虽然仍有不少问题有待解决，但相信随着PBSC研究的进一步深入，PBSC定量检测必将逐步从实验室走向临床，发挥巨大的作用。

表1 4种外周血干细胞分析方法的比较

	CFU-GM培养法	FCM法	SE-9500/9000	分子生物学方法
原理   方法   优点   不足     用途	集落形成能力   体外培养   特异、直观   费时、不能定量、重复性差   回顾性分析	荧光免疫法   荧光强度分析   准确、精密特异、快速 价昂、需特殊仪器、技术要求高   参考方法	细胞光学特性与膜脂质成分 RF/DC检测   经济、快速简便   特异性较差     可望用于allo-PBSCT中提供供者PBSC采集时机	检测CD34 mRNA 实时RT-PCR   特异、灵敏快速、准确 技术要求高，实验条件复杂   准确计数不同祖细胞亚群