解放军263医院  夏梦岩  高飞   李小静

　　阿米巴病是一种常见病和多发病，每年全球有5-10万人因阿米巴结肠炎和阿米巴肝脓肿（amoebic liver abscess,ALA）死亡，该病 的病原体是溶组织内阿米巴（E.histolytica,E.h）。E.h原虫在人体内以滋养体和包囊体两种形式存在，人感染E.h后既可出现严重的侵袭性阿米巴病症状，也可以处于无症状带虫状态。近年 来人们又逐步肯定还存在一种非致病性阿米巴原虫一地斯帕内阿米巴（E.dispar,E.d）,这种阿米巴在人肠道中处于共生状态，其遗传背景、形态和宿主与E.h高度相似，并且E.d的感染是E.h的9倍，过去估计的E.h感染率中很可能90%属于E.d感染。在这种背景下，只有正确的实验诊断才能为临床诊断和流行病学调查提供可靠的信息。现仅就近几年这方面的研究进展做一综述。

　　1   光学显微镜检查

　　1997年的WHO专题会议对E.h做了如下定义：E.h是一种单细胞真核生物，其滋养体直径20-40µm，有一个细胞核；包囊体直径为10-16µm，成熟包囊体有4个核，不成熟的包囊体有1个核，并有糖原泡，常含拟染色体。细胞核呈液性球状，被一层衬有染色抽粒的膜包裹，其中心含有一个小而圆的核仁。鉴于E.h和E.d的包囊体在镜下难以区别，WHO建议当镜下见到10-16µm包囊体时应报告“查到E.h/E.d包囊体”。该会议还指出活组织中的滋养体，以及新鲜粪便和其他标本中发现的内吞红细胞的滋养体与侵袭性E.h感染高度相关。在显微镜下除了E.d和E.h难以鉴别外，E.h包囊体和滋养体也很易与其他非致病性阿米巴包囊、白细胞和巨噬细胞混淆；另外，受包囊体间歇排泄的影响，光镜检查的敏感性也不足。

　　2   培养方法

　　根据培养基中其他微生物的存在状况，可将E.h培养方法分为有菌培养、单种培养和无菌培养。利用Robinson培养基从临床样本中培养E.h的阳性率高于光镜检查法，但低于检测Gal/GalNAc(半乳糖/N-乙酰氨基半乳糖)凝集素抗原的第二代ELISA试剂盒。该方法也有其缺点，培养出的滋养体仍需做红细胞吞噬和同工酶分析等实验才能确认是E.h抑或E.d；另外，受培养基、样本处理等因素的影响，光镜检查阳性而培养结果阴性的情况屡见不鲜。

　　传统的培养基在使用前必须加血清，否则E.h就难以生长。无论哪种培养基，都必须为E.h提供脂蛋白，在E.h是一种脂蛋白营养缺陷型生物。血清中的游离脂类对E.h的生长并无作用，相反，剂量 过大还可抑制其生长；血清成分还可掩盖E.h的某些毒性，从而影响研究工作。以上这些研究结果对培养基、疫苗和药物的研制都有重要的指导意义。

　　3   抗原检测

　　抗原检测具有早期诊断价值，但只是近些年人们才对E.h抗原的测定予以足够的重视。近两年一项重要进展就是证明了检测血清和唾液中Gal/GalNAc粘附凝集素抗原的临床意义。十年前人们就发现E.h的粘附凝集素作用能被Gal/GalNAc抑制，因而将此凝集素称为Gal/GalNAc凝集素，针对该凝集素的几种单抗可用以鉴别E.h和E.d。应用单克隆抗 体已经证明Gal/GalNAc凝集素抗原的存在于E.h感染高度相关。血清中存在的凝集素抗原是侵袭性阿米巴病的重要标志，而粪便中单纯Gal/GalNAc凝集素抗原阳性尚难以说明E.h已引起了侵袭性疾病，也可能仅处于非侵袭性定植状态。近年来人们应用第二代ELISA试剂盒又进一步证明了血清中该抗原不仅是诊断早期侵袭性阿米巴病的一项良好指标，而且也是一项良好的指标。例如：ALA患者在甲硝唑治疗前90%的患者血清阳性，治疗2周后91%转为阴性。唾液具备有血清的一些特征，唾液分析对许多疾病都反提供很有价值的信息。实验证明对阿米巴结肠炎来说，测定唾液中Gal/GalNAc凝集素抗原比测定血清中相应抗 体更敏感，也更特异。

　　除了ELISA方法外，近几年设计的测定抗原的方法还有协同凝集实验和胶体金方法。这两种方法因简便快捷而倍受青睐。前者用高效价的免疫血清致敏具有A蛋白的金黄色葡萄球菌后，测定血清中的循环抗原，结果诊断ALA的敏感性为90%，特异性为96%，假阳性率为8%，优于间接血凝方法。而后者检测粪便标本，诊断肠道阿米巴病的敏感性和特异分别为97.6%和92.6%，但因所用单克隆体与E.h和E.d都发生反应，影响了二者的鉴别，所测结果必须密切联系临床症状和相关实验，才能做出正确判断，另外作者也未说明该法能否测定血清循环抗原。

　　4   抗体检测

　　E.h感染人后，无论是否出现临床症状都会诱发明显的体液免疫应答，其中94%-100%的人血清抗体为强阳性，而E.d感染后强阳性率只有3%，与健康对照组无区别，这说明E.d并不诱发明显的体液免疫反应，而高滴度的特异性抗 体是E.h感染的重要指标。E.h的特异性抗 体主要是IgM、IgA和IgG。血清IgM出现最早，具有早期诊断价值。阿米巴结肠炎和ALA患者唾液中抗阿米巴IgA抗体的阳性率为90%-100%，而无症状的E.h感染期间无IgA抗体应答。测定血清中多克隆抗 体的一个缺点就是：抗体在感染后的患者体内可维持多年，难以区别是新近感染还是既往感染。有些资料证明Gal/GalNAc凝集素的特异性IgG抗 体在体内存在时间较短，是诊断急性阿米巴病的一项较特异的血清学实验。但甲硝唑治疗前的ALA患者血清阳性率仅为56.5%，低于相应抗原的检出率。对于恢复期ALA患者来说唾液中该抗体的敏感性为92%，特异性为97.4%；病程超过一周的阿米巴结肠炎患者两指标分别为83.3%和94.7%。这说明检测E.h特定抗原成分的抗 体对临床诊断仍具有较好的应用价值。
诊断阿米巴病的早期免疫学实验主要是利用间接血凝、免疫荧光和免疫电泳等技术测定血清中的多
克隆抗体，鉴于酶免疫法具有准确、快速、安全、简便等诸多优点，近几年设计的抗体测定法几乎均为ELISA法。测定抗体时必须注意各地区E.h的流行状况不同，健康人群的抗体水平差异比较大，只有在调查本地区的参考范围后，才能对实验结果做出合理的解释。

　　5   分子生物学法

　　近十年来，人们先后克隆了多条E.h和E.d的核酸片段，测定了它们的序列，明确了E.h和E.d在各片段上核苷酸序列的差别，利用探针杂交方法达到了鉴别两种原虫的目的。近几年来人们主要设计了一些以PCR为基码区的高础的检测和鉴别实验。这些实验所扩增的片段主要涉及：（1）rDNA非编码区的高度重复序列；（2）染色体外的环状rRNA基因；（3）半胱氨酸蛋白酶基因；（4）E.h表面抗原基因。扩增重复序列可能会得到不同长度的扩增产物，使电泳结果难以解释，并可降低实验敏感性；rRNA比单拷贝的rDNA易于检测，因每个细胞中rRNA的量约为200拷贝；半胱氨酸蛋白酶在E.h致病过种中起重要作用，检测该基因对阿米巴病的诊断和治疗都很有意义；而特异性表面抗原基因则是E.h存在的客观标志。

　　利用PCR技术，可通过下列二类方法达到鉴别E.h和E.d的目的。（1）利用共同引物扩增E.h和E.d后，通过观察电泳带位置和酶切图谱来鉴别E.h和E.d；（2）针对E.h和E.d分别设计特异性引物与探针，利用微孔杂交法达到鉴别目的。Gomes等利用其他实验组设计的引物P1-S17(5’-GCAACTAG TGTTAGTT-3’)和P1-AS20(5’-CCTCCAA-GATATGTTTTAAC-3’)从E.h和E.d中都扩增出了482bp的产物。虽然两种来源的扩增产物在琼脂糖电泳中处于同一位置，但在银染的聚丙烯酰胺凝胶电泳中E.d来源的扩增产物却有较快的运动性，在同一块凝胶板中，同时电泳两小时后，其电泳带位于E.h扩增产物之前，因而可将二者鉴别开。与其他方法相比，本法简便省时，但从作者提供的电泳照片来看，虽然E.h和E.d的电泳位置差别明显，但距离仍较近，笔者认为使用该法时，每次都应设两种标准虫株对照。

　　一般来说，核酸提取是PCR实验的首要步骤。但有人对已发表的10对引物做对比实验，发现应用其中三对引物分析脓汗时，样本无需预处理即可直接用于PCR，节省了时间和精力，并有非常高的敏感生。这三对引物是：P1(5’-TCAAAATGGTCGTCGTCTAGGC-3’)和P2(5’-CAGT-TAGAAATTATTGTACTTTGTA-3’)、P11(5’-GGAGGAG-TAGGAAAGTTGAC-3’)和P12(5’-TTCTTGCAATTCCT-GCTTCGA-3’)、Entf(5’-GGATTGGATGAAATTCAGAT-GT-3’)和Entr(5’-ATGTGTCCCTTTAAGAAGTGGT-3’)。P1+P2引物对扩增的是染色体外的环状DNA序列，扩增片段长度为125bp，该引物对退火温度要求相当严格，从55℃升至58℃时，敏感性即降低23%；P11+P12引物对扩增的是30KD的抗原基因片段，扩增产物长度为100bp。该引物对的一个缺点是PCR产物与引物二聚体的电泳迁移率很接近，无经验者会因误认而致假阳性。以上两对引物只能扩增E.h的核苷酸序列，而第三对则是E.h和E.d的共同引物，产物长度为420bp,经DdeI内切酶消化后，E.h会出现240、130和50bp三条电泳带，而E.d只出现290和130bp两条带。以上三对引物也适用于粪便等其他样本。

　　与抗原测定一样，粪便样本PCR的结果只能说明E.h存在与否，并不能直接说明是否已经引起了侵袭性阿米巴病。做PCR时还应注意粪便标本以新鲜为宜，因为粪便中的某些成分会降解DNA而使敏感性降低。

　　从生物鉴定角度看，分子生物学法鉴别E.h和E.d具有无比的优越性，但从临床应用角度看，就未必如此。Haquecf 对此研究了巢式PCR、ELISA抗原测定法以及经典的同工酶分析法，结果三者符合率在90%以上。虽然用PCR技术培养液中的原虫时，敏感性比ELISA法高得多，但检测粪便时两者敏感性几乎相同。鉴于ELISA法简便、快速、成本低廉等特点，他们认为一般实验室应用的ELISA法测定抗原更为适宜。
           

　　　　　　　　　　　　　　　摘自《国外医学临床生物化学与检验学分册》2002年23卷第二期