镇江医学院附属医院检验科   闻  平

    病毒性疾病的诊断主要依赖实验室检查，其检查类型可分为①分离培养病毒；②检出病毒抗原；③检出病毒核酸；④检测病毒抗体，但细胞培养分离病毒十分耗时，而病毒特异性抗体的检测在急性感染期的检出率也较低。流式细胞术是一种近年发展起来的检测技术，本文就这一技术在病毒检验中的应用作一综述。
    1、病毒抗原的检测与定量
    流式细胞术（FCM）既可用于检测受染细胞内的病毒抗原，也可检测受染细胞表面的病毒抗原。利用可特异性识别细胞表面或细胞内抗原的单克隆抗体，FCM可快速检测并定量受染细胞。常用的有直接和间接荧光抗体技术，前者用荧光标记特异性单克隆抗体，后者用未标记的一抗与受染细胞中的抗原结合，然后再将荧光标记的二抗与一抗结合。由于FCM检测的是单个细胞，因此FCM检测受染细胞适用于血液、支气管灌洗液、尿标本以及经酶消化过的组织细胞。同时由于FCM为多参数分析，因此将其用于病毒感染具有以下优点：可在单个细胞中同时获得多个分析参数；能定量检出受染细胞。当用不同荧光染料标记不同的病毒抗原特异性抗体或将特异性病毒抗体与不同大小的乳胶颗粒相联时，FCM可同时检测到同一样本中的多种病毒或病毒抗原。
    利用单克隆抗体检测不同时期的巨细胞病毒（CMV）抗原可诊断CMV感染。CMV感染是移植受体、AIDS患者等免疫抑制患者的常见并发症，利用FCM可在CMV吸附至成纤维细胞上30min后便可检测早期CMV抗原。因此FCM比传统的免疫荧光技术和培养细胞的病变检测等能更早期地诊断病毒感染。在活动性感染期间，CMV呈血行散布，病毒血症是发病的主要危险因子，尤其在同种骨髓移植受体。受染个体中病毒负载（virus load）的定量可作为CMV疾病发生的指标，并有助于鉴别有症状感染和无症状排毒，病毒负载量也是判断抗毒治疗效果的指标之一。诸如pp65抗原血症试验、定量PCR等敏感技术可用于全身性CMV负载的定量检测，但经典方法的操作繁琐，耗时较长，技术要求较高。最近研究以FCM直接检测并定量移植物受体嗜中性粒细胞（PMN）中CMV抗原，快速，并可实现自动化，因而显示出较好的特异性和理同性，在肾移植受体，FCM检测出的抗原血症水平与DNA水平极为一致。FCM可在CMV感染患者的外周血淋巴细胞中检出特异的CMV受染细胞，利用早期CMV抗原或受染外周血细胞的表面膜抗原的单克隆抗体建立的FCM法可快速定量骨髓移植受体的早期CMV抗原。患有CMV肺炎的移植受体PMN中CMV
　　特异性抗原检测结果表明，FCM抗原血症试验在预示移植受体是否存在CMV相关疾病是相当有用的。
　　外周血中巨细胞性内皮细胞的检测是诊断活动性CMV感染的双一方法，以FCM技术定量检测巨细胞性内皮细胞比传统的密度梯度离心偶联染色法不仅敏感了10倍，而且大大缩短了试验时间。以FCM监测肾移植 受体CD8+CD38+T细胞亚群的变化也可用于监测CMV感染，因为这种T细胞亚群常在活动性病毒感染时增高。用双色FCM检测了77例肾移植 患者移植后CD8+CD38+T细胞亚群的变化，结果表明所有感染CMV的患者CD8+CD38+亚群均为高水平，由此作者认为CD8+CD38+细胞的百分比可作为病毒性疾病早期诊断的免疫学指标。
    肝炎病毒标志物的定量及动态检测对病毒性肝炎的诊治十分重要。利用病毒特异性抗体FCM可检测出乙肝患者外周血单个核细胞（PBMC）中的HbsAg和HbcAg,35例慢性活动性乙肝及60例急性乙 肝的38例的PBMC中表达HbsAg。同样的方法也被用于乙肝患者B细胞和NK细胞中HbsAg、HbsAg，及丙肝患者HCV核心抗原的检测。
    FCM也可用于检测HSV-1，HSV-2和HHV-8受染细胞内HSV抗原。疑有HSV感染的临床标本经过夜扩增后，FCM便可检出其中的病毒抗原，因而比传统的细胞培养法提前1-3天作出诊断。这种技术也被用于临床及环境标本中的轮状病毒检测。
    利用FCM技术检测细胞内p24、p27、nef、gp120、gp160/gp41的表达情况以确定细胞培养物中是否有HIV受染细胞，这种技术用于定量检测时与逆转录酶试验、体细胞检测等常用方法相比具有敏感、准确快速等优点。用FCM检测PBMC中p18、p24nef、p18等HIV抗原阳性的CD4+细胞数可监测体内HIV复制情况，结果表明HIV抗原阳性细胞与CD4+细胞数量负相关，因此这些试验可用于快速监测HIV血清学阳性个体的疾病进展情况和抗病毒治疗效果。也可研究表明FCM检测到的细胞相关抗原与用标准的抗原捕获ELISA检测的HIV血清学阳性个体的血清HIV抗原间缺乏相关性，这可能与血清中存在免疫复合物，掩盖了部分抗原，使ELISA法不能检测到有关。
    2、病毒核酸的检测与定量
    PCR、RT-PCR等技术可极为敏感地检出被病毒感染细胞内的特异性病毒核酸（DNA或RNA），但当病毒核酸与单个细胞间的关联丢失时，这种方法将不能确定细胞是否受染。细胞悬液中原位杂交产生荧光的FCM分析可克服这种缺点。因为通过利用针对不同细胞标志的特异性抗体，FCM可给细胞表型定型。
    原位杂交FCM技术可检出外周血少见的产病毒细胞，经固定的悬液细胞，与标记有地戈辛-11-dUTP的HIV-1基因探针杂交，然后与荧光标记的抗地戈辛抗体反应，最后对由此产生的荧光信号作FCM分析便可检出受染细胞的HIV-RNA。这种技术用于CMV感染检测时感染后4小时便可检出T淋巴母细胞（MOLT-4）中的CMV-DNA，而传统的酶免疫技术只能在感染后4天才能检出CMV抗原pp65。当用于检测CMV感染患者PBMC中CMV-DNA时，15%的患者为阳性，而酶免疫的阳性率仅为0.9%。
    利用两种不同荧光标计探针的原位杂交技术与FCM相组合，Crouch等将细胞悬液中包括潜伏相和复制相在内的所有EBV感染细胞作了定量，这种技术可在9000个可疑细胞中检出一个阳性细胞，因而可用淋巴增生性疾病移植受体EBV感染的诊断。病毒PCR产物的非核素FCM分析作为传统的PCR核素分析法的替代方法得到很大发展，掺入地戈辛-dUTP的病毒特异性PCR扩增后，带有标记的扩增产物与生物素标记的探针杂交，杂交产物被包被有链霉亲和素的小球捕获，最后与FITC标记的抗地戈辛抗体结合，再行FCM分析。也称为PCR免疫反应珠试验（PCR-IRB）。该技术用于HIV-1检测时，可快速检出感染HIV-1的献血员PBMC中2-3个拷贝的HIV-DNA，其敏感性可与传统的PCR产物核素相媲美；双盲研究结果表明该技术与商品化Amplicor HIV-1 PCR试验盒检测结果完全吻合。用于HBV检测时，、更显示出该技术特异、敏感、快速的优点。
    以FCM检测荧光标记HCV特异性引物原位PT-PCR技术，可对临床血样中HCV受染细胞作定量检测，并同时对受染细胞作表型鉴定。传统的RT-PCR一般不能检出血循环中HCV受染细胞，而用该技术可在50%的慢性丙肝患者的PB-MC是检出HCV，受染细胞的比例为0.2%-8.1%。利用序列特性引物和地戈辛标记dUTP作悬液中固定细胞中病毒序列PCR或RT-PCR衍生的原位扩增，产物DNA与荧光素标记的寡核酸探针杂交，然后细胞悬液行FCM分析；这种技术已用于HIV感染者受染细胞中单个细胞内HIV-1DNA和mRNA检测，由于该技术还可同时确定受染细胞的表型，因此可定量检出特殊细胞群中HIV-1原病毒DNA和RNA分子，结果表明实测HIV-RNA阳性的百分比与由血浆RNA水平推算出和HIV-RNA细胞百分比显著相关。
    3、病毒抗体检测
    利用吸附有病毒抗原的聚苯乙稀微球作为载体的病毒抗体FCM分析技术已广泛应用。利用不同大小的微球，分别包被有特异性毒抗原后，可同时检测多种病毒抗体，如CMV和HSV抗体，或同时检出HIV-1的抗p31、gp120、gp41抗体，并可定量。当用FCM技术检测核HCV核心抗原、NS3抗原抗体时，其灵敏度比酶免疫技术高5倍左右。
    总之，FCM技术应用于病毒感染的诊断，具有特异性强、灵敏度高、操作可自动化等优点，具有广阔的应用前景。

　　　　　　　　　　　　　　　摘自：《国外医学临床生化学与检验学分册》2002年第23卷第2期