济南军区军事医学研究所   靳晓红  刘元东

    自从1882年Koch发现结核病病原菌结核杆菌以来，人们又陆续发现了约有一百多种非结核分枝杆菌，大多数非结核病分枝杆菌对人不致病，但二十世纪八十年代以来，随着艾滋病感染者人数的增多，播放型非结核分枝杆菌感染以及以往认为非致病的分枝杆菌引起人类疾病的报道不断增加，而其引起的临床症状与结核病十分相似，且大多对抗结核药物具有一定的耐受性，因此分枝杆菌的快速鉴定十分重要。传统的分类鉴定方法主要是表型分类法，是以形态和生理化特征为依据，时间较长（一般2-3个月）。分子生物学技术的发展，PCR技术的应用，开辟了分类鉴定的新途径。目前基因鉴定技术具有快速、简便、分辨率高的特点，并可进行多相分类鉴定，能按照种系进化的关系确定精确的位置和定种，使分类鉴定方法更客观合理。下面简要介绍以PCR为基础的分类鉴定方法。
    1、PCR-RFLP(PCR0Restriction fragment length polymorphism)
    通过PCR扩增分枝杆菌染色体上一段DNA，将扩增产物经限制性内切酶消化，将消化的样品进行琼脂糖凝胶电泳分析，不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同，电泳图谱呈现多态性。如对16-23srDNA基因PCR扩增，扩增片段（350bp）经识别4个碱基序列的限制性内切酶HaeⅢ、MPPI酶切消化后进行分析，可以鉴别不同分枝杆菌复合群。对分枝杆菌属特异的16srDNA片段PCR扩增，所得DNA片段(1500bp)经CfoI,MboI,RsaI酶消化，电泳分析酶切谱型也可对分枝杆菌进行鉴定。热休克蛋白（hsp65）基因保守性较强，存在于所有分枝杆菌，用PCR扩增hsp65的一段基因片段（439bp）并用BstEⅡ和HeaⅡ酶切消化分析34种分枝杆菌，显示出不同分子量的带谱图谱。Plikayti扩增标本hsp65基因，产生一条1380bp的序列，用BstEⅡ和XhoI消化扩增，19种常见分枝杆菌均产生可鉴别的带型，该方法可鉴定90%以上的致病性分枝杆菌。另外Niemann对 gyrB DNA序列扩增出1020bp的片段，用3种限制性酶酶切可以将结核分枝杆菌复合群分开。用PCR-RFLP的关键在于引物的设计和内切酶的选择。
    2、PCR-SSCP(PCR-single strand comformation polymorphsim)
    PCR-SSCP技术是目前应用较为广泛的一种鉴别不同DNA片段的分析技术，它可以区别单个碱基突变，该方法的原理是通过PCR扩增出的DNA，经变性产生两条互补的DNA单链，由于碱基序列及空间构象的不同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中呈现不同的带型。16srDNA中有些序列在进化中非常缓慢，有高度的保守性，还有一些部位，序列变化较大，可用来研究亲缘关系比较接近的种属关系，鉴定部分菌种。吴雪琼等设计了两对引物扩增16srDNA中的272bp片段，通过SSCP分析22种分枝杆菌，其中结核、牛型和BCG图谱相似，堪萨斯和腿分枝杆菌电泳图谱相似外，其他菌种之间图谱各不相同。该方法的弱点是实验易受凝胶温度的影响。
    3、PCR-核酸探针
    PCR-核酸探针是PCR与DNA探针技术相结合对分枝杆菌进行鉴定的方法，所用探针多为寡核苷酸探针，杂交方法有斑点杂交法，反向班点杂交法以及微板杂交法等。原理是利用分枝杆菌特异的基因序列，带上探针标记（如³²P同位素），来识别与之互补的特异性核苷酸序列，从而区别结核与非结核分枝杆菌。
    Takenaki等根据分枝杆菌特异的dnaJ基因序列，制备了结核、鸟、胞内和堪萨斯分枝杆菌4种特异性探针，分别与17种分枝杆菌的dnaJ基因PCR扩增片段杂交，结果结核分枝杆菌探针只与结核、牛分枝杆菌杂交，鸟、胞内和堪萨斯分枝杆菌探针分别与相应菌种杂交。李国利等根据16srDNA基因序列设计分枝杆菌属特异性引物，并合成了17种寡核苷酸探针，使之分别对应于分枝杆菌属的扩增产物，通过PCR-反向斑点杂交技术，将扩增产物同时与多种不同的探针杂交，而不必与每种探针——杂交，从而简化了实验步骤，提高了检测效果。
    用荧光标记PNA探针（peptide nucleic acid）与rDNA杂交来鉴别结核与非结核分枝杆菌也是一种可行的方法，Stender设计的结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌PNA探针对临床标本检测的敏感性分别达97%和91%，特异性达100%。该方法由于探针只能对相应的菌种呈阳性反应，具有高度的专一性，因此用于菌种鉴定时，需要合成较多数目的探针，从而限制其应用范围。
    4、PCR-核酸测序
    PCR-核酸测序，对特定的核苷酸靶序列进行序列分析，是鉴定菌种的可靠而准确的方法，如KimBJ对RNA聚合酶基因rpoB的扩增片段进行了基因测序，使快生长及慢生长菌很快区分开来，同时可以对是否是耐利福平药物的菌株进行鉴定。另外，对16-23srDNA间隔序列的扩增片段进行测序，发现慢生长菌中ITS基因序有很大的不同。Soini等报道通过扩增待检样品中分枝杆菌属特异的32KD蛋白基因片段（423bp）用Sanger双脱氧链末端终止法，测定了单链DNA的774到893位的核苷酸序列，可以将鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌序列以及堪萨斯、胃、戈登和马尔摩分枝杆菌相鉴别。对16srRNA高变异的123-275位基因片段的测序分析可鉴定16种分枝杆菌特异区域。65kD蛋白是分枝杆菌主要免疫反应蛋白之一，其属内基因的变异性比16srRNA更大，扩增其中的396-836位核苷酸产生一441bp片段，通过DNA序列测出识读出360bp的核苷酸顺序，25种分枝杆菌间未发现相同的基因序列。该方法缺点是需要昂贵的仪器，难以在基层推广应用。
    5、多重PCR（Multiplex PCR）
    多重PCR即在一个PCR反应体系中，设计多对引物进行扩增，这样产生不同特异性靶区域片段，经凝胶电泳观察各特异扩增片段，用于鉴定分枝杆菌至属种的水平。Thierry设计了扩增IS6110序列片段（325bp）及65kD蛋白基因片段（383bp）并对扩增产物进行分析，取得了较好的结果。Liebana报道了扩增16srDNA(1030bp)和MAB70的372bp基因片段，经琼脂糖凝胶电泳均可快速鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复合群。We CY设计了3对引物分别对IS6110、65kDshp和mtp40基因片段进行分析，从而鉴定临床标本。Ikonomopoulos JA则应用mpb64(243bp),IS6110(916bp)及65kD蛋白（383bp）的基因片段，对300个临床标本进行分析，可以快速检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、慢生长分枝杆菌复合群。多重PCR扩增条件要求严格，要优化PCR反应条件，以达到最佳扩增效果，降低扩增的错误率。
双重复插入序列PCR（double-repetitive-element PCR,DRE-PCR）
    在分枝杆菌染色体DNA中广泛分布着IS6110和富含重复插入序列，这两种重复插入序列的拷贝数和分布位置具有多态性，DRE-PCR是通过PCR扩增分枝杆菌基因组中这两种插入重复序列之间的片段，扩增产物电泳后出现多态性电泳谱，通过不同菌株的电泳谱，便可以确定它们是否属于同一克隆株或属于同一型。Stinear用溃疡分枝杆菌染色体中存在的插入序列IS2404和IS2606设计引物，扩增两者之间的间隔区，由于两者在数量和位置上存在多态性，因此扩增产物的数量和长度也呈多态性。
    总之，目前分枝杆菌菌种鉴定的分子生物学方法很多，均能对部分分枝杆菌进行快速鉴定，每种方法各有其优点，但还未有统一的标准化的方法，每个实验室之间的数据无法进行比较。因此技术方法的不断改进及分枝杆菌遗传信息的进一步详尽地了解，将使分子水平上的菌种鉴定技术得到进一步的完善，对于疾病的防治有重要意义。

　　　　　　　　　　　　　　摘自：《国外医学临床生物化学与检验学分册》2002年第23卷第2期