四川迈克科技公司生产的新一代单一液体α-L-岩藻糖苷酶（AFU）检测试剂盒，有效解决了该试剂稳定性差，抗干扰能力弱等缺陷......

α-L-岩藻糖苷酶（α-L-Fucosidase，AFU）是一种溶酶体酸性水解酶，分类名为α-L-岩藻糖苷岩藻糖水解酶（EC3.2.1.51）。基本生理功能是催化含岩藻糖基的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖苷的分解代谢。广泛分布于人体内的各种组织、细胞及体液中。如肝、脑、肾、胰、胎盘组织；细胞培养液中的成纤维细胞、白细胞以及血清、尿液、唾液、泪液和垂体液中均含此酶。

AFU在人体内呈多形性，有三型同工酶，即AFU1，AFU1-2，AFU2，是由1个位于第1号染色体短臂（1，P34）上基因位点的2个等位基因所表达，高活性的AFU1由基因FU1所表达，低活性的AFU2由基因FU2所决定，而AFU1-2则由FU1-FU2两个基因的杂合子所决定。各型同工酶的活性不一，依次为AFU1＞FU1-FU2＞AFU2，因此纯合子型表现为血浆AFU的高活性或低活性，而杂合子表现为中等活性。由于各人所表达的同工酶类型不同，所以正常人的AFU活性高低不一，大约有10%左右的正常血浆AFU呈现低活性。

利用等电聚焦电泳技术可将AFU分离出5～9条区带。尿液和白细胞AFU电泳酶谱以及它们的最适PH均较一致；肝、肾、胎盘AFU同工酶数目相近，而肾和胎盘中同工酶的等电点pI不同；血清AFU除了含有等电点pI为4.68和4.84两种主要组分外，尚可见到五种次要组分。血清AFU的分子量达270 000～390 000，远大于白细胞AFU的80 000±50 000和肝AFU的175 000±18 000。血清AFU分子中唾液酸的含量（1.7ug/100ug）接近肝AFU（0.96 ug/100ug）两倍。经过1%SDS和5%巯基乙醇处理的血清和肝AFU，用聚丙烯酰胺凝胶电泳各见到两种分子量十分接近的亚单位。血清AFU亚单位的分子量略大于肝AFU。AFU分子的多态性很可能由于决定这些蛋白性质和分子中唾液酸残基的存在，说明确实存在核蛋白体合成后的修饰作用。这种修饰作用引起分子携带电荷的差异，也使血清AFU独具特性。

有资料表明，脑与肝AFU具有抗原一致性，而用肝AFU制备的抗体IgG可与纯化的血清AFU发生免疫沉淀反应；血清AFU的反应最适pH在4.8左右，pH6.1处可出现一个次要的“最适”pH峰（活性60%～70%），与脑、肝AFU之间曲线类似，而且三者的Km值比较接近，提示血清和脑、肝AFU之间存在抗原特性和动力学特征的一致性。

纯化的血清AFU在50～65℃时可达最大反应活性，温度系数Q10为1.9。经50℃加温30分钟、60分钟和120分钟后，分别失活15%、23%和42%。与白细胞AFU的热稳定性比较，在醋酸钠缓冲液中经55℃加温10分钟，血清AFU的剩余活性为88%，在无醋酸钠介质中仅26%；而白细胞AFU的剩余活性则分别为56%和68%。

Cu2+、Hg2+、Ag+、对氯汞苯甲酸和胆盐对白细胞AFU有强烈抑制作用；这种抑制作用可被巯基乙醇逆转，提示AFU分子中含有酶活性必备的巯基。Zn2+和Fe3+也有弱抑制作用，AFU2抑制率为65%和48%。而K+、Na+、NH4+、Ba2+、Ca2+、Mg2+、F-、NO3-、I-、PO43-、COO-和抗坏血酸等在0.1～5.0mmol/L浓度范围内对酶活性均无抑制。

遗传性AFU缺乏可使含岩藻糖基的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖苷这些物质从初生儿起就在组织中堆积，引起岩藻糖苷贮积病。组织细胞、尿液和血清中AFU测定可协助该病的诊断，并借以与其他遗传性粘多糖贮积病鉴别，这也是早期对AFU检测的主要目的。1980年Deugnier等发现原发性肝癌（PHC）病人血清AFU升高，并被后来的研究所证实。从此，对AFU 临床意义有了全新的认识。

近年来大量的资料表明血清AFU是原发性肝癌的标志物和诊断的可靠指标，原发性肝癌病人（PHC）血清AFU活性不仅显著高于对照组，而且显著高于继发性肝癌、胆管细胞癌、恶性血管内皮细胞瘤、恶性间皮瘤、肝硬化、先天性囊肿和其它良性肝占位病变。血清AFU对原发性肝癌诊断的阳性率在64%～84%之间，特异性在90%左右。

目前对原发性肝癌患者血清AFU活性升高的机制尚不清楚，可能是肿瘤细胞合成AFU后大量释放至血流；降解减慢（正常时可能肝脏星形细胞能识别和清除AFU分子中的甘露糖-6-磷酸残基，在原发性肝癌时此能力消失）；肿瘤细胞坏死破裂；因代谢紊乱致使正常组织受损引起AFU释放增多；肝癌时可能存在某些促进合成、抑制清除因子参与有关。

报告者	时间	原发性肝癌		肝硬化		继发性肝癌		良性肿瘤		急性肝炎
报告者	时间	例数	阳性率	例数	阳性率	例数	阳性率	例数	阳性率	例数	阳性率
梁纪等	1989-1995	995	79.6%	398	13.1%	96	15.6%	87	2.3%	357	12.3%
王小玲等	1995	46	82.0%	28	5.6%					42	0
何敏等	1996	36	80.6%
翟飞等	1997	24	87.0%
毛翠华等	1997	38	71.0%	28	14.3%
吴亚萍等	1998	108	74.1%	42	4.2%			8	0
梁纪等	1989-1995	47	72.3%	213	62.0%					255	61.2%

进一步研究表明，血清AFU活性升高与AFP无相关性，AFP阴性的PHC病人有58%-81%血清AFU活性升高。血清AFU升高幅度和阳性率与病灶的大小无明显关系，病灶<3cm的病组血清AFU升高的阳性率为70.8%-80.0%，明显高于AFP阳性率（37.5%-40.0%），而且AFP的升高多见于晚期病例。原发性肝癌患者经手术治疗或化疗后，病灶局限时，其血清AFU活性降低；复发或恶化时活性再度升高。所以，测定血清AFU是诊断原发性肝癌的一项有效指标，而且对观察病情和判断预后也有重要的价值。因与AFP无明显相关，如两者同时测定，可将原发性肝癌的检出率提高至90%以上。

六例PHC患者术前、术后AFU活力（nmol/ml.h）测定结果

年龄	术前AFU活力	术后AFU活力
36	896	398
38	776	386
64	541	260
59	596	254
70	492	194
35	965	410

肝硬化和急性肝炎

肝硬化和急性肝炎（特别是重症肝炎）病人血清AFU活性也可升高，与原发性肝癌有重叠现象宜加注意。大多数肝硬化或肝炎病人的血清AFU活性升高的幅度较低，肝炎病人血清AFU活性和血清ALT高度相关（γ=0.850），且一经抗肝炎治疗后血清AFU活性迅速下降，；肝硬化病人的血清AFU活性则与血清ALT呈分离趋向（γ=0.497）；而原发性肝癌病人血清AFU活性则与血清ALT呈负相关（γ=-0.33），可资鉴别。但若病人血清AFU活性长期升高提示常易发展为肝癌，或已有小病灶肝癌存在，或表示病情危重。所以有人认为血清AFU活性测定，有助于肝硬化病人发生恶变的预测。同时发现肿瘤组织中的AFU活性却明显下降（下降幅度可达40%），而其AFU的耐热性、对底物特异性和亲和力及同工酶谱却与正常组织的AFU无显著变化。此现象可能是肝癌组织中AFU向血液释放增加，它部分地解释了肝癌细胞中AFU减少和血清AFU升高的原因。

Abdel Aleem等测定101例妇科各型肿瘤病人及50例女性对照组血清AFU活性发现，90%的恶性卵巢肿瘤患者其血清AFU活性明显低于妇科其它肿瘤病人及对照组。以275Ku/L为临界值，据此诊断卵巢恶性上皮癌的敏感性和特异性分别为88.5%和98%。与CA125相当，但检测费用仅为CA125的三分之一，特别适合发展中国家应用。

测定61例肾病患者血清AFU活性，均显著高于正常。肾病综合征组显著高于其它肾病组，与内生肌酐清除率呈正相关；慢性肾功能不全组血清AFU活性与尿素呈显著性负相关。由此表明血清AFU活性与肾脏病的发生与发展有密切关系。检测血清AFU活性可作为反映肾脏疾病病情的参考指标。

糖尿病患者（N=75）血清AFU活性显著高于对照组（N=36）（P<0.01），糖代谢控制差组血清AFU活性明显高于糖代谢控制好的病组，后者与对照组无显著差异，故测定血清AFU活性可作为糖尿病病情控制的观察指标。

Besly等报道，B细胞性慢性淋巴细胞白血病患者白细胞AFU活性明显低于其它类型白血病，认为这与B细胞属性无关，而是恶性细胞的增殖产物。

此外部分胃癌、胰腺癌患者也有少数病例血清AFU活性升高。测定胸腔积液中AFU活性对诊断积液性质无鉴别价值。

近十几年来，随着对AFU的深入研究，检测方法也不断发展。目前对AFU的主要检测方法从放免法、荧光法、化学显色法到速率法/连续监测法不断更新：

仪器条件要求高，样品及试剂需特殊处理，目前多不再使用。

利用AFU水解4-甲基伞型酮α-L-岩藻吡喃糖苷释放4-甲基伞型酮，用碱性缓冲液终止反应，并使产物呈现荧光，用360nm或365nm激发波长和400nm或448nm发射波长检测荧光强度，对照不同浓度4-甲基伞型酮制备的标准曲线求的酶活性。此法敏感性高，最小检测出限0.06U/L。既适用于血清，也适用于活检组织、细胞、脑脊液和泪液等量小的生物物质，以及AFU低活性的样品，如岩藻糖苷贮积病病人的样品。但该法对仪器条件要求高，也不适用自动化检测。

以4-硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷为底物经AFU水解释放4-硝基苯酚（4-NP）后，用碱性缓冲液终止反应，使4-NP呈显著黄色，在规定波长下读取吸光度A。用纯4-NP作标准，利用标准曲线或4-NP的摩尔吸光度计算出AFU活性。本法简便、设备要求不高，但由于酶底物本身的抗干扰性差，基质效应明显，不能解决血清黄疸和溶血、脂血等因素对测定结果的影响，尤其在肝脏疾病诊断中最为突出。且操作较繁琐，也不适用自动化检测。国内医院现使用的商品试剂大多数为该法。

以AFU在最适反应条件下催化含呈色基团（常用对硝基苯类）的特定底物水解，在一定波长下可使吸光度值增加。连续检测吸光度值的变化，可计算出样本中AFU的活性。该类方法操作简便，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都有所提高，适用于各种半/全自动分析仪器，便于临床单位推广应用。根据底物的不同，又可分为PNP法、CPNP法、M-G-CPNP法。

PNP法底物为对硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷，灵敏度一般，对溶血、黄疸仍表现出一定的基质效应，精密度也较差。同时由于反应pH值为6.1，只能达到60%～70%活性，临床对该法有所争议。

CPNP法是90年代发展起来的方法。采用氯化对硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷作底物，灵敏度和精密度较PNP法都有了很大的改善，但仍未完全解决溶血、黄疸及脂血的基质效应。同时由于剂型多为干粉复溶，稳定期短，用户使用成本高。目前也有部分国内厂家推出PNP/CPNP法试剂盒。

M-G-CPNP为国外新型底物，产品的灵敏度、精密度、抗干扰性及试剂稳定性都非常高，是当前最先进的检测方法。我公司的AFU检测试剂盒即采用该方法，也是目前国内唯一采用该方法的厂家。

方法	反应时间	灵敏度	CV%	抗干扰性	剂型
终点显色法	37℃ 60分钟	低	1.80	差受溶血/黄疸/脂血影响大	干粉
改良终点法	37℃ 5分钟	中等	2.46	较差受溶血和黄疸影响大	液体
PNP法	37℃ 5分钟	中等	6.20	较好溶血/脂血/黄疸影响较小	液体/干粉
CPNP法	37℃ 5分钟	高	2.10	较好溶血/脂血/黄疸影响较小	干粉
M-G-CPNP法	37℃ 5分钟	极高	1.14	最好对溶血/脂血/黄疸有良好的抗干扰性	单一液体

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适用性：适用于各种半/全自动生化分析仪器可向用户提供部分专用包装

建议用户根据各自的情况建立期望值（参考值）范围

正常人不同年龄组血清AFU活性

年龄	例数	AFU活性（U/L）
20～29	26	21.8～32.0
30～39	17	20.9～30.9
40～49	10	20.0～34.8
50～59	15	22.2～34.0
60～69	23	19.0～35.2
70～90	4	16.6～38.0

正常人不同性别血清AFU活性

性别	例数	AFU活性（U/L）
男	40	21.3～33.7
女	45	20.2～33.2
总计	95	20.7～33.5

注意事项

1. 本法禁止使用肝素和枸橼酸盐抗凝血浆，可使用EDTA-Na2、草酸钠，NaF血浆。

2. 本试剂反应线性期长，为了更好地发挥试剂性能，建议用户在设置参数时延迟时间应大于90秒，以更好的减少共存物质的基质效应。

3. 如果样品中AFU活力超过300U/L，则用生理盐水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。

4.试剂与样品量可根据需要按比例改变。

5. 试剂使用后立即关紧瓶盖，避免污染。

6. 试剂变混浊或空白吸光度值大于0.700，将不能使用，应弃去。

附2：对M-G-CPNP法测定AFU活性的基质效应分析

四川迈克科技公司技术部

血清AFU是原发性肝癌的标志物和诊断的可靠指标，目前国内大多数医院使用的商品试剂为终点法试剂，该法由于酶底物本身的抗干扰性差，对溶血、黄疸表现出明显的基质效应。临床使用效果极不理想。

我公司根据市场需要，从国外引进新型底物（M-G-CPNP-α-L-Fucoside），并优化反应体系，加入人工合成的抗溶血干扰剂Er916和采用抗黄疸、脂血缓冲体系，使试剂具有抗干扰性强、精密度较好，基质效应不明显的特性。历时近两年的实验临床应用评价，结果稳定，性能达到设计要求。正式向国内市场推出。现就对该试剂的基质效应分析报告如下：

实验方案

取临床新鲜混合血清（MEAN=125U/L）分为9组，每组又分成5管并依次编号，分别向其中加入以下干扰物质，样品中干扰物质最终浓度如下：

组别	干扰物	1＃	2＃	3＃	4＃	5＃
1	血红蛋白（mg/L）	625	1250	2500	5000	10000
2	胆红素（μmol/L）	37	75	150	300	600
3	乳糜微粒（%）	0.1	0.2	0.5	1.5	2.0
4	Vit.C（mg/L）	219	438	875	1750	3500
5	肝素（