细菌编码鉴定法
发布时间:02年08月28日 10:51 细菌的编码鉴定法是细菌检测、鉴定的传统经典的方法, 是根据Bascomb(1978)、Lapage(1973)与Willcox(1973) 等人的理论编制而成，其具体操作过程如下：
一、培养物选择
将SS琼脂 、MacConkey琼脂、EMB琼脂、BTB琼脂、血琼脂或TCBS琼脂平板分离培养在进行编码鉴定之前, 要检查培养物的纯度。将菌株分别划线接种于营养琼脂平板 (少数菌用血琼脂), 30℃培养18～24h。如划线平板上生长的菌落分布均匀，有可供观察的一定数量单个菌落，通过不同光角观察和比较其一致性。如菌落形态一致，可选择单个菌落接种营养琼脂斜面，作为鉴定用菌株；如菌落形态不一致，则再挑取培养物划线培养，直到菌落形态一致或4/5一上菌落一致时为止。菌落形态一致的菌落 ，经30℃培养18～24h后，涂片，干酪素革兰氏染色，镜检。在染色特征上应为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，菌体形态应一致，并无杂菌污染时，接种营养琼脂斜面(血琼脂斜面), 30℃培养18～24h后即可进行编码鉴定。
二、接种生化反应管
用接种针挑取少量纯培养物(或单个菌落)在无菌条件下, 分别接种于ONPG、精氨酸(及其对照管)、赖氨酸和鸟氨酸(及对照管)、柠檬酸盐、硫化氢、尿素， Sim、V-P、明胶、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁甙、阿拉伯糖等19种系列生化培养基中。其中精氨酸及其对照培养基、赖氨酸和鸟氨酸其及对照管培养基, 在接种后各加灭菌液体石蜡0.5ml , 放37℃培养。发酵型细菌在18～24h、氧化型细菌在24～48h观察判定反应结果。
三、结果判定
新编码鉴定培养基实验结果判定要点见表2。
(一) ONPG
测定细菌产生半乳糖酶的能力。细菌产生半乳糖酶, 培养基变黄色, 不变色为阴性。
(二) 精氨酸双水解酶
测定细菌产生精氨酸双水解酶的能力。精氨酸经细菌产生精氨酸脱酰酶作用, 可降解为瓜氨酸和氨。瓜氨酸经瓜氨酸酰脲酶作用降解为鸟氨酸、二氧化碳和氮。培养基呈碱性变红色为阳性, 不产生精氨酸双水解酶的细菌, 培养基不变色为阴性。
(三) 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶
测定细菌产生氨基酸脱羧酶的能力。细菌产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸羧基脱出, 生成胺类和二氧化碳。培养基呈碱性变紫色为阳性, 呈黄色为阴性。不含氨基酸的空白对照培养基为黄色。
(四) 柠檬酸盐利用
测定细菌能否利用柠檬酸盐为碳院碳源的能力。细菌利用柠檬酸, 可分解为二氧化碳, 培养基呈碱性变兰色为阳性。
(五) 硫化氢
测定细菌产生硫化氢的能力。许多细菌能分解培养基中的半胱氨酸产生硫化氢, 它同培养基中的铁盐形成硫化铁, 呈黑色为阳性，无黑色产生为阴性。
(六) 靛基质丙酮酸(IPA)
测定细菌是否产生靛基质丙酮酸。此种反应，是由于细菌将蛋白胨中的色氨酸脱氨而产生靛基质丙酮酸，它与培养基中的柠檬酸铁引起的反应 。阳性者在SIM培养基表层数mm处部分呈褐色, 无此变化这者为阴性。
(七) 吲哚
测定细菌产生吲哚的能力。某些细菌含有色氨酸脱氨酶, 分解蛋白质中的色氨酸生成吲哚 , 加Kovac氏二甲基氨基苯甲醛试剂后, 使与靛基质结合形成红色的玫瑰吲哚, 即为阳性, 不变色为阴性。
(八) 尿酶
测定细菌产生尿酶的能力。细菌产生尿酶, 分解尿素形成大量的氨, 培养基呈碱性变红色为阳性, 不变色为阴性。(九) V-P反应
测定细菌将葡萄糖分解为丙酮后并进一步转化成乙醛甲基甲醇的能力。乙醛甲基甲醇加试剂后被氧化生成二乙酰, 它与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用, 生成红色化合物即为阳性, 不变色为阴性。
(十) 氧化酶
测定细菌产生氧化酶的能力。细菌产生氧化酶时, 可氧化二甲基对苯撑二胺, 使之呈紫红色为阳性, 不变色为阴性。将氧化酶试验纸条用蒸馏水浸湿, 用白金丝接种环或灭菌竹签挑取18～24h培养的菌苔 , 涂抹于试验纸上。10秒内出现紫红色为阳性, 10～60秒内出现紫红色为延迟反应, 10～60秒钟以上不变色为阴性。
(十一) 糖、醇类
在鉴定系列生化中，糖、醇类培养基使用溴麝香草酚兰做指示剂。当糖、醇被发酵或氧化后, 生化管的顶部或全部变黄色为阳性，不变色为阴性。
四、编码计数与菌名检索
新编码盐鉴定法采用21项生化特征 , 每3项为一组, 计有7个组。每组的3项生化，凡阳性结果者其数值分别记为1、2、4，反应阴性者记为0，尔后，分别将各组数值相加，依次组成一组7位数值的编码，即代表所鉴定的菌株的相应菌名。查 《革兰氏阴性杆菌新编码鉴定手册》中的检索表，找出这7位数码相对应的菌名 。如一株拟态弧菌的编码为7206520, 查《手册》检索表相对应的菌名为梅氏弧菌( Vibrio metschnikovii), %id=99.9, T=0.74为很好的鉴定(见表3)
表3 一株拟态弧菌的编码鉴定计数及菌名检索(示例)
| 第1位数 | 第2位数 | 第3位数 | 第4位数 | 第5位数 | 第6位数 | 第7位数 | 鉴
定
结
果 | | Ｏ
Ｎ
Ｐ
Ｇ | 精
氨
酸 | 赖
氨
酸 | 鸟
氨
酸 | 柠
檬
酸 | 硫
化
氢 | 尿
酶 | Ｉ
Ｐ
Ａ | 吲
哚 | Ｖ
│
Ｐ | 明
胶 | 葡
萄
糖 | 甘
梨
醇 | 肌
醇 | 山
梨
醇 | 鼠
李
糖 | 蔗
糖 | 蜜
二
糖 | 苦
杏
仁
甙 | 阿
拉
伯
糖 | 氧
化
酶 | | １２４ | １２４ | １２４ | １２４ | １２４ | １２４ | １２４ | 反应结果 | ＋＋＋ | －＋－ | ＋－－ | ＋－＋ | ＋－＋ | －＋－ | －－－ | 梅
氏
弧
菌 | 应得数值 | １２４ | ０２０ | ０００ | ０２４ | １０４ | ０２０ | ０００ | 组合编码 | ７ | ２ | ０ | ６ | ５ | ２ | ０ | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
四. 编码检索表的使用
在手册的编码检索表中, 能够查出的编码, 存在以下几种可能性:
(一) 鉴定到某一分类单元, 即只有一个分类单元被检出。
(二) 鉴定到"种的水平", 同一个种中的2、3或4个生物型同时被检出。
(三) 鉴定到"属的水平", 同一个属中的2、3或4个分类单元同时被检出。
(四) 鉴定的结果"识别力低",不同属中的2、3或4个分类单元同时被检出。
(五) 性状编码在本手册编码检索表中查不到当某个菌的性状很不典型或概率极低时, 可以出现此种情况。也有可能是新种, 需要进一步鉴定。 本手册的革兰氏阴性杆菌新编码鉴定系统, 还能同时提供以下资料: 1. 列出两个数值:
鉴定概率(%id)--- 表示某个菌的性状与分类单元之间的密切程度。
T --- 表示某个菌的性状与每一个分类单元的最典型反应之间的关系, 即期望值。期望值在0～1之间, 它与不典型试验成反比。 2. 按鉴定概率进行鉴定结果的质量评价及T检验 , 包括以下4 种 情况: 最好的鉴定%id≥99.9 T≥0.75 很好的鉴定%id≥99.0 T≥0.5 好的鉴定%id≥90.0 T≥0.25 识别力低%id≥80.0 T≥0 3. 有些菌的鉴定结果, 属于种的水平、属的水平或者识别力低时, 要参照该编码栏右侧列出的补充试验做进一步检查, 完成最后鉴定。 有关补充试验的技术方法, 请参照文献进行。 4. 下列各种情况, 记载在编码检索表栏内, 在此做一说明。
参见概论 --- 指用本手册提供的方法鉴定为鼠疫耶尔森氏菌 、霍乱弧菌、 类鼻疽假单胞菌时，必要时应将将鉴定菌株送国家指定的专门机构进一步认定。 经血清学试验证实--- 指鉴定为 志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌时，应进一步用血清学方法加以鉴定。 有欧文氏菌的可能--- 见于成团肠杆菌2、3或4的栏内。
有河流弧菌的可能 --- 见于嗜水气单胞菌的栏内。
有鲁氏耶尔森氏菌的可能 --- 见于蜂房哈夫尼菌 2的栏内。
有植生克雷伯氏菌或土生克雷伯氏菌的可能 --- 见于肺炎克雷伯氏菌的栏内。
有植生克雷伯氏菌的可能 --- 见于产酸克雷伯氏菌的栏内。
上述五种情况，均属于推测性鉴定，应进一步按规定做补充试验加以鉴别。
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