胶束增敏法测定血清铜
   曹建明，方芳，李敏，陆永绥（温州医学院检验系，浙江温州325003）

　　《全国临床检验操作规程》中推荐的血清铜分光光度测定法（简称铜试剂法），灵敏度低，血清用量大，且需去蛋白，操作步骤繁。本研究在前期研究基础上，参考有关文献，建立了表面活性剂TritonX-100及聚乙烯吡咯烷酮（PVP）存在下，用2-（3，5-二溴-2-吡啶偶氮）-5-二乙氨基酚（简称，3，5-diBr-DAPAP）作显色剂胶束增敏分光光度法测定血清铜的新方法。本法灵敏度高，准确度好，试剂简单稳定、且不必去蛋白，操作快速简便。现报道如下。

1、 材料和方法
1．1．1  铜标准液   31.48umol.L-1,按常规法配制.
1．1．2．显色液    称取3，5-diBr-DAPAP（北京化工厂）0.10g,用无水乙醇加到100ml作为贮备液,取10ml贮备液加10ml Triton X-100,5.0Gpvp,用0.5mol．L^-1 Ph4.0醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至1000ml,即得显色液。
1．2    方法法配制.﷒1．2 方法
1．2．1   自动分析仪分析参数  反应类型：终点法：波长：575nm（主）/700nm（次）；校准方法：Linear；反应温度：37℃；试剂Ⅰ（显色液）：250ul；试剂Ⅱ（3%H2O2）：5ul；标本：20ul；读数时间：300S。
1．2．2 手工分析操作方法  测定管（U）、标准管（S）、空白管（B）分别加入血清、铜标准液、蒸馏水各0.2ml,每管各加3% H2O2 0.05ml,显色剂2.50ml,混匀,置37℃水浴保温5min,用1cm光径比色杯,在575nm波长处,读取各管吸光度A.按下式计算:
血清铜浓度(umol. L-1)=A测/A标X31.48

2、结果
2.1 吸收曲线   按本法对标准管、测定管进行显色，在UA-2201紫外可见分光光度计上扫描，测得标准管、测定管两者络合物最大吸收波长均在575nm处。
2．2 表面活性剂影响  3，5-diBr-DAPAP与Cu2+形成络合物水溶性较差，试验发现在反应系加入表面活性剂Triton X-100或PVP，能使体系保持清亮，透明且起增敏、增溶、增稳作用。当Tritor X-100及PVP两种表面活性剂同时使用时，测定的灵敏度比单独使用时提高约15%。本法选择在1 000ml显色液中加入10ml Truton X-100及5.0g PVP。
2．3 线性范围  取一定量Cu2+按本法进行测定，结果表明Cu2+含量在0~63.0umol.L^-1 范围内线性良好,回归方程为Y=6.75X10-3X- 0.002(X为Cu2+浓度),r=0.9994,表明摩尔吸光系数为9.18CX104L.mol^-1 .cm^-1
2． 4回收试验  取已测得Cu2+含量为15.83unol.L^-1 的血清标本分别加入7.85、15.70、23.55unol.L^-1 铜标准液进行回收试验。回收率分别为98.5%、102.8%、101.3%,平均回收率为100.8%。
2．5 精度度 取低、高两种Cu2+浓度样本各1份，用本法各平行测定20次，低浓度度批内测定的平均值密-=17.49umol.L^-1 ,CV=3.1%;高浓度批内测定的平均值x-=28.81umol.L^-1 ,CV=2.4%,另取低、高两种浓度各1份，每天上、下午各测定一次，连续7天，每天平行2次，低浓度批间测定的平均值x-=13.55umol.L^-1 ,CV=3.9%,高浓度批间测定的平均值x-=32.70umol.L,CV=3.3%.
2．6 方法对比试验  血清铜含量在(8.5~23.7)umol.L^-1 范围的血清标本30例,用本法(Y)和原子吸收法(X),进行血清铜含量的平行测定.本法测定平均值为(16.35±3.64)umol.L^-1 ,原子吸收法测定值为(16.38±3.53)umol.L^-1 .回归方程为Y=1.02X-0.46,r=0.9935,经配对t检验.t=1.16<2.045,两者无显著差异(P>0.05)。
2．7 干扰试验在本法测定条件下，测定Cu2+含量为15.83umol.L^-1 相对误差小于5%时,各干扰离子允许量:Na+180mmol.L^-1 、K+15mmol.L^-1 、Na2+10mmol.L^-1 、Mg+10mmol.L^-1 、Zn2+53umol.L^-1 、Fe3+53umol.L^-1 、Hg2+5umol.L^-1 、Pb2+5umol.L^-1 、Mn2+3umol.L^-1 ；血清中胆红素含量低于102umol.L不干扰,血清中Hb低于50mg.L^-1 不干扰。脂血标本有干扰。
2．8 参考值范围   检测66例体验健康者（男40例，女26例，年龄20~50y）。空腹静脉采血，用本法测得血清铜含量（x-±s）：（16.1±3.8）umol.L^-1 。参考范围（x-±2s）；（8.5~23.7）umol.L^-1 。

3 、讨论
3．1  要准确测定血清铜必须使血清铜在合适pH条件下全部从蛋白质中解离释出，然后与显色剂作用。当pH太低时，血清蛋白质易沉淀；pH太高时，血清铜解离不完全，回收率偏低，故本法选择在pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液中进行测定。置37℃水浴保温5min，则可保证血清铜完全释出。
3．2  操作时注意防止铜污染。使用的吸管、试管必须经10%硝酸或盐酸浸泡过夜，洗净干燥备用。若用一次性聚乙烯试管效果更佳。测定时所用的比色皿最好专用，以防交叉污染。溶血和脂血样品会使结果偏高。但用标本作自身空白对照时，即可避免干扰。
3．3本法测定用的试剂组成简单、性能稳定（置室温至少可稳定一年）。Cu2+与显色剂反应生成的络合物至少可稳定12h。测定时的灵敏度高（ε为136X104L.mol^-1 .cm^-1 ）法的管6倍;用本法测定血清铜，血清用量少，不必去蛋白质，具有操作快速、简便、结果灵敏可靠等优点，适合临床应用。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　摘自《临床检验杂志》2002年第20卷第2期