中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所   范明远

一、恙虫病立克次体
　　恙虫病立克次体（Rickettsia tsutsugamushi）又名恙虫病（tsutsugamushi disease）的病原体。该病原体为专性细胞内寄生菌，通过媒介恙螨叮咬而传播。临床上以突然高热，虫咬溃疡（焦痂），皮疹和淋巴结肿大等为主要特征。目前证明世界上有恙虫病流行地区只有亚洲和大洋洲，包括日本，泰 国和中国在内的地区是该病的重要疫区，已被视为再度肆虐人类的传染病之一。有专家呼吁应把恙虫病重新列入法定传染病，主要介绍如下。
微生物学检验
1. 样品的采集与处理
（1）恙螨
　　从鼠体上采集的恙螨幼虫，分类鉴定后按种类100只以上分为一组，置于预先滴以400U青霉素，200ug链霉素各1滴的消毒凹玻片中，于4℃冰箱置24h，再用无菌镊子、小刀尖或小玻棒将恙螨研碎，加入1ml无菌生理盐水制成悬液作为接种材料，或者预先不加抗生素，直接研碎制成悬液再加抗生素，立即接种动物，立克次体分离阳性率也较理想。
血液
　　病人血液为分离立克次体的最好材料，在抗生素应用前自患者静脉采血5-10ml放入离心管中，若在3d内进行分离，最好用冰浴保存。300×g离心5-10min。血清做免疫学实，剩余血块用消毒盐水洗涤后，置入盛有消毒细砂的乳钵内，剪碎后仔细磨加一倍盐水，制成乳剂，作为接种材料。若血液用肝素处理，300×g离心5min-10min后，上清液做免疫学实验，将白细胞层分离，悬于SPG中，进行动物接种。
　　（3）尸体
　　恙虫病患者尸体的血块、脾、脑、肝、肾和肿大的淋巴结等经研碎后，加5-10倍量盐水或肉汤制成乳剂，取其上清液作接种材料，如客观上不允许作尸体解剖时，可在腹部开一小口，取1-2g重的脾组织作接种材料。此外，也可用延髓穿刺术取脑进行动物分离培养。
　　（4）鼠类、家兔和其它动物
　　用无菌操作从腋下或心脏采血1-5ml留作血清反应用，打开腹腔，剪下肝、脾、肾、分别或混合在一起，用盐水制成乳剂，取上清液作动手分离培养的材料。
2. 检验程序（增菌、分离培养、鉴定）
（1）病原体分离
　　①动物接种法：分离恙虫病立克次体以小白鼠最敏感，一般用小白鼠腹腔接种方法。取上述材料接种小白鼠3-5只（0.5-1.0ml/只）。接种后5d死亡者多为其它原因，一般于6-14d发病死亡。死亡前出现皮毛竖松，行动迟缓，闭目呆滞，呼吸急促，腹部膨大等症状。在动物频死时解剖常常可见皮下充血，鼠蹊部淋巴结肿大充血，腹腔有粘性渗出液，脾肿大可为正常的1-5倍。如果观察18-21d动物不发病，可取其肝、脾、肾悬液盲传三代，仍无病变者则判为阴性，不再传代：如脾肿大仍很明显，应继续传代，常有经过6次以上传代发现立克次体者。
　　近年研究表明，在小白鼠中有无毒株存在，动物常无明显发病症状，从而导致分离失败。因此，这些分离株常用环磷酰胺（CY）处理过的小鼠和无胸腺小鼠进行分离。每只被毛小鼠接种0.5ml血块悬液或白细胞悬液，接种后第1、2、4d每只小鼠每克体重接种0.2mgCY,若小鼠不出现症状，则在第7d再接种一次，接种10-14d处死小鼠。解剖可见轻度脾肿大，腹壁有大量粘性渗出液，收集肝脾，同时腹膜涂片，Giemsa染色或IF检查立克次体生长，如涂片可见立克次体，说明分离成功。若未见立克次体生长者，可取肝脾用SPG制成10%悬液接种CY处理后的小鼠进行盲传，一般盲传3代。每代均进行恙虫病立克次体的抗体检测。
　　②组织培养分离培养法：恙虫病立克次体可在Hela细胞，地鼠肾细胞多种单层细胞中良好生长，部分毒株可用组织培养细胞传代。由于裂解血细胞对分离细胞有害，因此常自肝素处理的血液分离白细胞匀浆物0.1ml接种于管中的细胞上培养。35℃-37℃培养。第3-4d换液一次，并通过Giemsa染色或IF检查细胞。必要时可将细胞转到一个新的培养瓶中。如45d后仍不见立克次体生长，则认为分离失败。
（2）恙虫病立克次体的鉴定
　　①形态与染色性，恙虫病立克次体典型形态为双球杆菌状，两端浓染，大小在500um左右，细胞内繁殖，位置常在靠近细胞核的原浆内，核内不见生长。Giemsa染色，呈紫红色，背景呈淡蓝色。
　　②血清学鉴定，微量免疫荧光试验：用20或40孔玻片或用油膜笔在玻片上面画上方格，用蘸水钢笔尖取抗原（以PBS制成的5%感染卵黄囊悬液，或用2%正常卵黄囊稀释的纯化抗原，浓度为100ug/ml）点在玻片上（每个抗原用一个笔尖），自然干燥，丙酮固定10-15min，加不同稀释度（用含10%正常卵黄囊PBS作2倍稀释）的病人血清和免疫血清，置37℃60min，用0.01mol/LPBS(PH7.4)荡洗（10min/次，共3次），加荧光抗体，37℃60min，荡洗，吹干，加缓冲甘油。每张玻片作阳性及阴性血清对照。采用双盲法由两个人在荧光显微镜下检验。凡能观察到黑暗的视野中有明确发荧光的立克次体，而在各对对照不能发现者，判为试验阳性。在间接微量免疫荧光试验中， 一般滴度在1：16或以上为阳性。
　　补体结合实验：血清标本先用盐水作1：4或1：8稀释，灭活后加0.05ml于有机板（U型板）第一孔内，然后用稀释度的血清0.025ml，逐孔加入抗原及补体（均含2单位）各0.025ml,振荡混遁辞，加盖后置室温（18℃-22℃）4h，每孔加致敏绵羊细胞0.05ml混匀，置37℃15-30min，观察强果。结果判定和阳性标准：血清最高者稀释倍数呈++++（完全不溶血）、+++（75%细胞不裂解）、++（50%细胞不裂解）、+（25%细胞不裂解）、一（全溶）。以++为终点，抗体滴度达1：8即为阳性。但对立克次体诊断，恢复期血清滴度高于急性期4倍以上有诊断价值。试验时应设血清抗补体，补体、溶血素、绵羊细胞等对照，必要时作正常抗原，阳性及阴性血清对照。
　　③分子生物学鉴定和分型：根据血清学反应进行恙虫病立克次体的分型鉴定时，各型交叉反应广泛。近年多采用PCR技术进行恙虫病立克次体的分型鉴定。郭恒彬等根据恙虫病立克次体外膜蛋白56kda抗原基因分别设计了恙虫病立克次体的群、型特异引物，对现场标本及分离株进行分型鉴定取得了较好的效果。
二、斑点热群立克次体
　　斑点群立克次体（spotted fever group rickettsiae,SFGR）是引起斑点热的病原体。该群立克次体为专性细胞内寄生菌，呈二分裂敏殖，革兰氏染色阴性。目前证实对人有致病性的有十余种。病原性斑点热群立克次体主要通过蜱或螨的呆咬而传播给人。立克次体侵入机体后，多在小血管内皮细胞及网状细胞系统中增殖，引起血管炎，血管周围炎及器官病变。人感染发病后则出现发热，虫咬溃疡，局部淋巴结肿大，皮疹和头痛等症状。该群立克次体在蜱或螨等节肢动物及哺乳动物间维持着持久的感染循环。近年由于人们对节肢动物传播疾病的重视，病原体分离检测技术的提高和一系列生态学及人类行为的改变，斑点热的发病率有上升趋势，且不断发现新的自然疫源地和新的致病或非致病的斑点热群克次体。围绕该群病原体进行了大量有关生态学，流行病学及分类学的研究。主要介绍如下。
微生物学检验
1. 样品的采集和处理
　（1）人体标本：一般采集全血和血块。在病程第一周内。未使用广谱抗生素前采集血液5-10ml，床旁立即接种动物。如不立即接种，可将血脱纤维，或加肝素抗凝。也可取淋巴结，皮疹切除组织。尸检取脑、脾、肝标本一小块，研磨、用稀释液制成10%-20%悬液（一般100-1000U/ml），置室温半小时，经低速离心后取上清液接种。
　（2）动物标本：
　　①野生小动物，在野外捕获的啮齿类动物用少量乙醚轻度麻醉取心血致死，分离血清。按常法解剖动物，取出脾、脑、肾、睾丸等冰冻保存。以同地区同种动物若干只的脏器混合研磨制成悬液。
　　②蜱：在自然界采蜱可用拖旗或摆旗法。以上午9-10时草地露水晒干后进行为宜，收集爬附在旗上蜱类。或直接自野外捕获的类动物体表收集蜱。其中饱血蜱进行血淋巴实验。将血淋巴实验阳性或可疑阳性者按相同来源的同种蜱10-15只为一组，经生理盐水洗涤3次，75%酒精浸泡30min，生理盐水洗涤3次后，研磨，用含青，链霉素（各500U/ml）的SPG制成1：10悬液。
　　上述人体标本（血块），动物脏器及蜱标本处理后分别可进行病原体分离及PCR检测。
2.  检验程序（增菌、分离培养、鉴定）
①斑点热群立克次体分离和培养
　　豚鼠分离：SFGR中除小蛛立克次体可用豚鼠及小鼠两种动物分离外，其它种立克次体的初代分离多用雄性豚鼠。接种前应测豚鼠体温，并采集血液2ml备作血清学试验，以确定是否有隐性感染，亦可作为接种标本后的血清学反应的对照。将病人血液或其它标本悬液至少接种两只豚鼠，每只腹腔注射2-4ml。一只待发热高峰剖杀取脏器研磨传代或接种鸡胚卵黄囊以敏殖立克次体。另一只留至恢复期（接种后28d）采血，以检测特异性补体结合抗体。用睾丸内接种（每只0.25ml）或腹腔及睾丸同时接种者，有时能获得迅速稳定的发热反应。对有杂菌污染的标本或用蜱悬液分离时，可作皮下注射1ml，或一只鼠作腹腔接，另一只为皮下接种，或用蜱叮咬豚鼠法。每天观察豚鼠体温和阴囊反应，取感染豚鼠的脏器或睾丸鞘膜渗出液涂片、镜检、传代、或取恢复期血清进行血清学鉴定。
鸡胚卵黄囊培养法：取病人发热血液或血块肉汤或蜱悬液，接种孵育在38℃-39℃的6-8日龄健康鸡胚孵黄囊内，每次5个鸡胚为宜。每胚约注射0.5-1.0ml，33℃孵育，每天检查，3d以前死亡的鸡胚弃之。最近几代的鸡胚可不死或死亡时间延尺，一般传3-5代逐渐适应，鸡胚接种6-8d死亡。死亡后可继续孵育2-3d，集中解剖。涂片、染色、镜检。
　　离心细胞培养：将待检标本悬液加入500ul含有10%胎牛血清的Eagle′s液，将瓶置于37℃，5%CO₂箱孵育，短则48h，长者6d可见细胞病变，并有大量立克次体增殖。
②斑点热群  立克次体的鉴定
　　显微镜检查：取感染发病的豚鼠脏器，睾丸鞘膜、腹膜、腹水标本、鸡胚卵黄囊、细胞等涂片、Giemsa染色、立克次体为红色，背景呈绿色，结合分离原标本来源及感染动物发病表现，进行初步鉴定。
　　血清学试验：实验动物在感染后，会产生特异性抗体，故可用已知斑点热群立克次体抗原或标准血清做微量免疫荧光试验或补体结合试验进行初步鉴定。
操作方法参见恙虫病立克次体
　　分子生物学鉴定：斑点热群立克次体种类繁多，其抗原成分复杂，种间交叉反应严重。因此单纯血清学方法已难以满足当前分类鉴定的需要。目前PCR/RFLP已广泛应用于现场标本中斑点热群立克次本的检测及初步鉴定和分离株种水平的鉴定。认为我国目前存在三种斑点热群立克次体：西伯利亚立克次体，黑龙江立克次体，内蒙古立克次体。
3.  注意事项
　　用节肢动物分离时应注意：（1）最好取活标本分离。采集及运送，保持合适的温度与湿度；（2）保持肢体完整，初步分离后，一部分置70%酒精中留作种群分类鉴定，其余用作分离或PCR检测；（3）有的立克次体的饱食为佳，或将饥饿蜱置37℃孵育2d-3d；（4）在制作悬液前，将标本以无菌生理盐水洗涤，加抗生素或紫外线照射杀死体表杂菌，为避免操作时节肢动物逃逸，可先将其置3℃-5℃冷藏片刻；（5）采集的动物标本，可适应筛选宿主血清学反应阳性分离。
埃立克体
　　埃立克体（Ehrlichia）是引起人类埃立克体病的病原体。目前世界上已发现了3种人类埃立克体病，即查菲埃立克体（Ehrlichiachaffeensis）引起的人类单核细胞性埃立克体病（Human Monocytic Ehlichiosis, HME）；类马埃立克体（E.equi-like orgamism）或称人类粒细胞埃立克体引起的人类粒细胞性埃立克体病（Human Granulocytic Ehlichiosis, HE）; 由腺炎埃立克体（E. sennetsa）引起人类腺热（亦称传染性单核细胞增多症）。这3种人类埃立克体病中，前两种是最近才被人们所发现的。埃立克体病是以热带、亚热带为主全球性分布的感染性疾病，近年由于新的埃立克体不断被发现，该病起广泛重视。血清学研究证明我国云南地区军犬和健康人中存在犬埃立克体立克体抗体，人广东病犬、血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus）及广西的微小牛蜱（80philus microplus）扩增出犬埃立克体的基因片段。我国不少地区常有发热待查，或类似埃立克体病临床表现的病例的发生，提示可能存在有埃立克体病，值得研究证实。主要介绍如下。
1.  病原学检查
　　直接涂片镜检：对于埃立克体病的早期诊断，直接镜检吞噬细胞内生长的埃立克体是一最简便的方法，可见单核细胞或粒细胞内呈圆形深紫色的包涵体。在25%-80%的HE病人的感染早期血片的嗜中性粒细胞的胞质内，观察到埃立克体的桑葚样包涵体。但是在HME病人的血片单核吞噬细胞的胞质内，发现埃立克体的概率则很小。
细胞培养：体外细胞培养分离血液标本中的埃立克体，是确诊埃立克体感染的最可靠方法。本菲埃立克体能够在犬的巨噬细胞系（DH82）中迅速生长繁殖。从可疑病人的血中分离白细胞，将其接种预先培养好的DH82细胞单层; 1周后，每隔3天取细胞涂片姬姆萨染色，检查DH82细胞胞质中是否有埃立克体包涵体。
　　动物接种：C3H/HeJ小鼠对查菲埃立克克体感染敏感。接种HME病人的血液标本11d，从小鼠的血和脾脏中，均分离到查菲埃立克体，用PCR也从这些标本中扩增到该病原体，抗体在感染的小鼠体内可持续存在超过6个月。将HEE病人的血液标本接种3CH/HeJ小鼠，5d后可在小鼠外周血片的中性粒细胞中观察埃立克体包涵体，可持续到感染后第40d。采用环磷酰胺和切除脾脏抑制小鼠的免疫功能均能提高小鼠对埃立克体感染的敏感性，增加敏殖量或延长埃立克在体内的滞留时间。将血液标本接种体外细胞，将提高分离埃立克体的阳性率。
2.  血清学检测
　　微量免疫荧光试验：HME病血清学反应有两种：一种是用特异的查菲埃立克体抗原检测的微量免疫荧光试验；另一种是用犬埃立克体作替代抗原，用前一种抗原与病人的血清进行间接免疫荧光试验敏感性较后一种高。一般抗原的滴度在发病后第3周增高。抗体滴度呈4倍升降或≥1：64滴度可作现患诊断。由于人类粒细胞埃立克体尚未培养成功，目前用于HE的血清学反应只有一种，即用马埃立克体（E.equi）代替代抗原检测IF。只要在病人的血清里查到抗马埃立克体高滴度的抗体或呈4倍升降的抗体滴度，可认为是人类粒细胞性埃立克体病。
　　特异性核酸检测：由于细胞分离培养较为困难，而采用扩增DNA的PCR，仍能在标本中埃立克体含量不多时，检测出埃立克体特异性核酸，因此PCR比血清学反应敏感，80%-87%的HE病人的血标本PCR扩增结果为阳性。
四、肺炎衣原体
　　肺炎衣原体病，是指肺炎衣原体（Chlamydia pmeumomiae）引起的一种人类急性呼吸道感染症，以散发形式流行，症状轻且能自愈，重复感染者甚为流行。第一株肺炎衣原体，于1965年从台湾省的一儿单眼部用鸡胚分离出来的，暂名为TW-183.1983年从美国西雅图一患咽炎大学生咽部分离一株AR-39。后来证实为同一种衣原体，将两者组合成TWAR株。在沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体之外，1989年TWAR被正式确定为衣原体属的第3个种一肺炎衣原体，并列入Bergey´s系统细菌物册。
　　在与肺炎衣原体感染相关的临床病症中，已肯定有病原学关系的疾病有：支气管炎、鼻窦炎、耳炎和肺炎；尚未十分肯定有病原学关系的疾病有：哮喘、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化症、心内膜炎、心肌炎、心包炎、红斑结节，散在性肉芽肿和多发性硬化症。主要介绍如下。
微生物学检验
病原体分离试验，。以细胞培养法为佳。鉴定程序如下。
　　标本制备：将收集的标本放于含10%小牛血清和抗菌素的EMEM培养基中，在4℃下1000g×45min离心，然后将沉淀物再悬浮于含抗菌素新鲜EMEM中，如果PCR方法已经建立，留部份标本作PCR。直径的圆形盖玻片，并在每一孔中放含HEP-2细胞×105的EMEMlml,将细胞培养板置孵箱中，35℃培养。
　　标本接种：将上述1ml标本，用2000g×45min离心，可将标本的衣原体压入宿主细胞，再加入含入放线菌酮1ug/ml和抗菌素的EMEM培养液1ml，同时平行作实验室衣原体株和空白标本，作为已知阳性和阴性对照。2000g离心时可在35℃下进行。在35℃培养72小时，取片观察，从孔底取出圆形盖玻片时，绝对不能损伤生长在表面的细胞片。
　　免疫荧光染色：用属或种特异性的单抗作直接或间接免疫荧光染色，寻找固定在盖玻片上经染色后的包涵体，此项操作技术亦可直接在培养板上的小孔中进行。
　　传代培养：用超声波或研磨刮下的细胞片，按上述程序接种新鲜的细胞片。
　　血清学试验,常用微量免疫荧光（1F）或补体结合试验（CF）。
　　机体感染肺炎衣原体后，抗体出现表现两种模式：一是青少年初次感染后的免疫反应，早期出现补体结合抗体，几周后才出现免疫荧光抗体；二是成年人，经常出现再次感染的免疫反应，免疫荧光抗体lg（; 6周后才出一。诊断标准：微量免疫荧光，急性期抗体呈4倍增长或1gM≥11:16, lgG≥1:512,既往感染lgGl:8-1:256; 补结试验急性期，双份血清滴度增长或≥1：64.
　　特异性核酸PCR检测，由于细胞分离培养较为困难，感染后lgG存在时间长，再感染时lgM和补结抗体又常为阴性。血清学反应较难分初次感染和再次感染。特异性核酸的检测是诊断肺炎衣原体的快速方法。TWAR原体所独有的DNA片段是PSTI酶切的474bp，引物是根据基因库分析，G+C比例确定的。所用的两对引物是HL-1HR-1和HM-1-HR-1，被检标本均能被两对引物所扩增，扩增成预期的437bp和229bp产物。具有很高的特异性。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　摘自：《中国检验医学用品》2002年第1期