启东肝癌研究所  陆东东

　　研究表明，部分肝癌患者在肝切除或肝移值前体循环血中已滞留有肝癌细胞或存在目前CT、MRI、US、单抗放射显像等影像技术尚不能发现的微小转移灶。假若血循环中的肝癌细胞能在治疗前被检出，对肝移植受体选择及移植前有针对地加用化疗等辅助治疗将起很大的作用。对肝癌切除术后血液中存在肝癌细胞的患者加强监测，可提高（包括AFP阴性肝癌）术后复发或转移灶的检出率。对肝癌切除及介入治疗（TAE、PEI等）前后患者外周血肝癌细胞量的动态变化及其应用化疗药物后的关系进行研究，将为肝癌围手术期全身化疗提供有力的病理定量依据，并可依其更合理地安排肝癌化疗的程序，提高化疗效果，降低化疗的毒副作用。本文就肝癌围移标记研究作一综述。

1   肝癌转移标记的研究近况

　　1.1  细胞学检查  有人报道，在手术期间抽取门静脉血，提取有核细胞作HE染色后镜检，可发现脱落的肝癌细胞，但这对检测少量在体循环中肝癌细胞显然是不合适。

　　1.2  肝癌的诊断标记  目前临床诊断肝癌的标记：甲胎蛋白（AFP）及其异质体（AFPr）、异常凝血酶原（DCP）、谷氨酰转肽酶同功酶Ⅱ（GGT-Ⅱ）、岩藻糖苷酶（AFU）等皆为血清中肿瘤相关性蛋白或酶类，与肝癌的体积、病程、TNM分期等相关性小，对监测肝癌是否发生转移能力的细胞粘附分子CD44在肝癌中基本不或很少表达，不能作为肝癌的转移标记。

　　1.3  ALb mRNA 和AFP mRNA  近年来，有关癌症转移标记的广泛研究主要集中在肿瘤的突变基因或其相关基因的表达上，最近，有学者应用RT-PCR来检测外周血蛋白（Alb）和AFP mRNA来反映血液循环中肝癌细胞的存在与否。

　　1.3.1  ALb mRNA  人类白蛋白基因位于第4号染色体上，长约17kb，有15个外显子，在肝细胞中表达最高，睾丸、子宫、胎盘等组织器官中也有相应表达。有人发现，用RT-PCR测定外周血白蛋白 mRNA可反映肝癌患者循环血中是滞有肝癌细胞的存在，但其结果显示ALb mRNA针对肝癌细胞的特异性较差。有人发现用巢式PCR检测外周血ALb mRNA，所有健康志愿者（26例）和肝癌、肝炎、肝硬化者（63例）血液ALb mRNA全部阳性，提示血液中有核细胞如白细胞、淋巴细胞等的白蛋白基因也可能表达。研究结果的不同估计与巢式PCR的灵敏度高于RF-PCR有关，该作者认为不能将ALb mRNA作为血液中存在肝癌细胞的标志物。

　　1.3.2  AFP mRNA  甲胎蛋白基因和白蛋白基在一佯位于第4号染色体上，长约20kb，有15个外显子。AFP主要在卵黄囊和胎儿肝脏内合成，出生后即随白蛋白的合成增多而迅速下降。AFP基因在正常成人肝细胞中仅微弱表达，在肝癌细胞中表达强烈。有人应用巢式RT-PCR来检测外周血AFP mRNA，发现肝癌患者外周血中其阳性率为52%（17/33），其中有明显肝外转移的患者100%阳性（6/6），未发现有转移灶的肝癌患者阳性率为41%（11/27）；肝硬化和慢性肝炎患者的阳性率分别为15%（2/13）、12%（2/17）；26例健康受试者全部阴性。双叶或弥漫性肝癌患者AFP mRNA阳性率高（87%），肿瘤直径>5cm的大肝癌（82%）也较小肝癌（19%）高。另有报道肝癌患者中AFP mRNA阳性率为36%，有肝外转移的阳性率为100%（6/6），正常对照组全部阴性，8例转移性肝癌阴性，有些AFP阴性肝癌患者中也出现阳性AFP mRNA与前者差异最大的是31例肝炎、肝硬化患者无1例血中发现AFP mRNA。

2   外周血AFP mRNA检测研究

　　一组研究显示，共35例健康受试者外周血AFP mRNA全部阴性，说明血液中有核细胞不表达AFP mRNA。而游离于细胞外的mRNA很不稳定，极易被Rnase酶解，因此，外周血测得AFP mRNA提示血循环中存在完整的肝癌细胞或肝细胞。但RT-PCR检测不能区别AFP mRNA是来自肝癌细胞还是正常或变异的肝细胞。另外检测时尚需排除能分泌AFP的其它肿瘤细胞相关基因是否表达的灵敏方法，可检测到5ml血液中100-1000个HepG2肝癌细胞；Nested-RT-PCR可检测到5ml血液中100-1000个HepG2肝癌细胞，对35份样本单独2次检测，其中33份前后结果一致，符合率达94%。可见，只要严格操作，设立对照，注意防止污染，Nested-RT-PCR的结果是可靠的。

3   外周血AFP mRNA检测的临床意义

　　3.1  肝癌术后复发监测  AFP加US是目前肝癌术后复发转移最为常用和有效的监测手段。但我国仍有30%-40%的肝癌患者AFP阴性，US也存在不能发现隐蔽的微小复发转移灶的可能。血液中出现癌细胞是肿瘤血源性转移的关键环节，因此认为外周血AFP mRNA的检测能弥补AFP加US的不足，加强术后对血液中AFP mRNA阳性患者的随访能提高肿癌复发转移灶的早期检出率。

　　3.2  肝癌患者肝移植受体选择  肝移植治疗肝癌目前已取得明显进展，但有些患者移植前血液中已有播散的肿瘤细胞或非目前各种影像检查尚不能发现的微小转移灶，移植后长期使用抗排斥的免疫抑制剂，机体抵抗力进一步下降，促使残癌细胞增殖、扩散、复发。尽管血液中存在肿瘤细胞并不等于肿瘤患者已有或必定发生转移，但在供肝来源紧张、肝移植尚未普遍应用于治疗肝癌的今天，选择外周血AFP mRNA阴性的患者作受体，对于降低肝移植后肝癌的复发，提高治疗效果有其一定的临床意义。

　　3.3  作为肝癌围手术期化疗的依据  有人发现，部分外周血AFP mRNA阴性的肝癌患者经过PEI、TAE治疗后转为阳性，这与临床上观察到有些肝癌患者接受上述介入治疗后短期内出现肝癌转移的现象一致。新近的一些研究表明，术前、术中和术后全身化疗可提高小肝癌甚至晚期肝癌患者肝癌切除或肝移植后存活率。因此，可望利用Nested-RT-PCR来检测肝癌患者在接受手术或介入治疗前后血液中AFP mRNA的动态变化，为肝癌围手术期全身化疗提供有力的病理生理依据。

4   结语

　　用Nested-RT-PCR来检测外周血AFP mRNA，样本采集方便，检测灵敏度高，加上AFP基因表达的相对组织特异性，AFP mRNA很有希望成为肝癌转移的标记指示物。但其仍存在许多问题有待进一步解决：（1）AFP mRNA对有肝外转移的肝癌非常敏感（100%），但未发生转移的肝癌患者也有较高的阳性率（40%），这些患者将来是否会发生转移及其与AFP mRNA量值的相关性有待进一步随访研究。（2）Nested-RT-PCR不能区别AFP mRNA是来自肝癌细胞还是正常或变异的肝细胞，检测中发现慢性肝炎和肝硬化患者有一定的假阳性，在此不能排除部分肝癌患者的AFP mRNA阳性是由肝炎、肝硬化的脱落肝细胞引起。（3）缺乏肝癌患者手术、介入治疗前后外周血AFP mRNA的动态变化及其与全身化疗的效应关系研究。

摘自：《中国检验医学与临床》2000年6月第1卷第2期