江苏省临床检验中心  许斌

    一  技术背景
    在基因诊断技术发展史中核酸分子杂交发展最早，于1961年开始研究。最经典的方法是Southern印迹法，主要用于DNA的检测；随后又发展出了Northern印迹法（检测RNA）和斑点杂交法等。它是直接对样品中靶序列的测定。杂交法灵敏度不够，据报道最敏感的核酸探针仅能检出103～104拷贝的靶分子，而多数临床标本中靶分子量远低于此限。1980年代中期，以PCR技术为主的体外核酸扩增技术的发展，使低拷贝临床标本的检测成为可能。PCR能使样品中靶序列的的拷贝数特异性地快速扩增105～107倍，将检测阈值降至1～10拷贝数，大大提高了杂交检测的灵敏度。
    在基因诊断领域中，PCR只是用于扩增靶核酸的数量，从而提高检测灵敏度；核酸杂交才是提高基因诊断特异性的关键。两者的结合促进了基因诊断技术在临床的广泛应用。
    1.基因诊断（核酸检测）技术的发展
           核酸分子杂交（Southern Northern）
                           (检测103～104拷贝靶分子)
                       ↓             ↓            ↓
                   靶序列扩增      探针扩增      信号放大
                     PCR          Q复制酶系统     b-DNA
                  TMA、
                  3SR、      （可检测1～10拷贝靶分子）
                  LCR
          

表1  常见PCR产物分析方法

方法       原理                           定量    时间       费用
  
凝胶电泳   辨别电泳条带                    否     2～8h      $5
杂交       印迹\斑点\原位                  否     8～24h     $ 5～10
ELADA    AMPLICOR(COBAS)                   否/半  4h         $ 35
RFLP       限制酶切多态分析                否     8～10h     $ 5
SSCP       单链构象多态分析                否     2d         $ 4
序列分析    核苷酸排列分析                 部分   1～2d      $ 10
HDP        异构双倍体分析                  否     8～12h     $ 5
CFLP       裂解片段多态分析                否     1d         $ 20
NIRCA      非同位素RNA酶裂解分析           否     1d         $ 50
LiPA        线性产物分析                   部分   8h         $80
实时分析    荧光定量                       是     0.5～1h    $15

    2.聚合酶链式反应
    （1）Polymerase chain reaction,简称PCR，1985年由美国Centus公司人类遗传室的科学家Kary Mullis创立（1993年获诺贝尔化学奖）。特点：特异性较强，灵敏度高，简便快速，应用广泛。缺点：错配，假阳性，假阴性。
    （2）PCR产物分析方法。
    （3）实时检测PCR（Real-Time PCR）

表2  常见实时检测PCR仪

品名          公司      温控     标本量        原理          时间
5700，7700，  ABI     压缩机     96/批        TaqMan        ～2h
6700*
iCycler iQ    Bio-Rad    半导体   96-384/批   TM, FRET, 信标   ～2h
LightCycler    Roch      空气      32/批     TM, FRET, 信标   ～2h
SmartCycler   Cepheid   半导体    16-96/批    TM, FRET, 信标   ～1h
MX4000     Stratagene   压缩机     96/批         信标        ～1.5h
RotorGene     Corbert    空气      32/批     TM, FRET, 信标  ～50min

a.Taqman技术
    合成一段在5’端和3’端分别带有荧光报告基团（R）和淬灭基团（Q）的特异性探针，当PCR扩增时，探针与模板序列杂交；而当上游引物延伸至探针结合位置时，探针被具有5’外切酶活性的Taq酶解离，R和Q基团分离，能量转移关系不复存在，在激发光作用下R基团发出荧光。荧光强度随PCR扩增产物增加而动态性增加，起始靶DNA拷贝数的量与Ct值（循环周期数）相关。

    b.Amplisensor技术 
    首先要进行一个不对称扩增，再加入特异的Amplisensor双链信号引物，进行半巢式扩增；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消失，产物量与荧光成反比。

    c.分子信标技术（Molecular beacon）  探针5’和3’末端自身可形成一8个碱基左右的发夹结构，当溶液中有模板序列时，探针环序列与模板杂交，探针的发夹结构被破坏而线性展开；此时，荧光分子与淬灭分子分开而发出荧光。荧光强度的增加与PCR产物量成正比。

    d.荧光能量转移（FRET）  将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，发光探针的5’端连接荧光分子，淬灭探针的3’端连接淬灭分子；由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子便紧密相邻，从而发生能量转移而使荧光淬灭。荧光强度与起始模板量成反比。

    二  诊断试剂管理
    1 由SDA管理
    2 报批程序  （1）申报（提供试剂盒方法学性能及相关资料）；（2）生物检定所（Kit性能指标评价）；（3）临床考核（SDA确认的三家以上单位）；（4）新药证书；（5）GMP认证；（6）生产许可证（试、准）。
    3 已通过SDA审批的临床基因扩增检测试剂盒列表（2002年3月止）

表3  通过SDA审批的PCR检测试剂盒

生产厂家                     试剂盒名称                         新药证书编号                      生产批准文号

深圳匹基                  乙型肝炎荧光试剂盒                国药证字（1999）S-48           国药试字S2000000
                          丙型肝炎荧光试剂盒                国药证字（2000）S-01           国药试字S20000008
                          结核分枝杆菌荧光试剂盒            国药证字（2000）S-41           国药试字S20000008
                          沙眼衣原体和淋球菌荧光双检试剂盒  国药证字S20010011              国药试字S20010011
中山大学达安              乙型肝炎荧光试剂盒                国药证字（1999）S-50           国药试字S19990003
                          丙型肝炎荧光试剂盒                国药证字（2000）S-44           国药试字S2000000
                          结核分枝杆菌荧光试剂盒            国药证字（2000）S-43           国药试字S20000006
                          沙眼衣原体荧光试剂盒              国药证字S20010067              国药试字S20010084
上海久盛                  乙型肝炎-酶免试剂盒               国药证字（2000）S-16         
                          结核分枝杆菌-酶免试剂盒           国药证字（2000）S-10          
                          沙眼衣原体-酶免试剂盒             国药证字（2000）S-36         
广州蓝星                  乙型肝炎-酶免试剂盒               国药证字S20010044         
                          结核分枝杆菌-酶免试剂盒           国药证字S20010065          
                          沙眼衣原体-酶免试剂盒             国药证字S20010057
上海浩源                  乙型肝炎-酶免定量试剂盒           国药证字（2000）S-02
厦门安普利                乙型肝炎-荧光试剂盒               国药证字S20010063  
                          结核分枝杆菌-荧光试剂盒           国药证字S20010066        
                          沙眼衣原体-荧光试剂盒             国药证字S20010001           
华美                      乙型肝炎-酶免试剂盒               国药证字S20010064         
                          结核分枝杆菌-酶免试剂盒           国药证字S20010024          
                          沙眼衣原体-酶免试剂盒             国药证字S20010011
上海复星                  乙型肝炎-杂交梳试剂盒             国药证字（2000）S-15         
                          结核分枝杆菌-杂交梳试剂盒         国药证字（2000）S-17 
                          沙眼衣原体-杂交梳试剂盒           国药证字S20010011  
上海申友                  乙型肝炎荧光试剂盒                国药证字S20010023
                          沙眼衣原体-酶免试剂盒             国药证字S20010020

   三、实验室管理
   1 由卫生部管理
   2 依据：卫医发2002第10号“临床基因扩增实验管理暂行办法”。
   3 相关文件：卫生部临床检验中心：《临床基因扩增实验室工作规范》、《临床基因扩增实验室申请表》、《临床基因扩增实验室验收表》。
   4 程序  （1）填写调查表——由省临检中心审核；（2）正式填写申请表——上报部临检中心；（3）评审——由部、省专家参加并报省卫生厅备案；（4）合格单位名单由卫生行政部门在媒体公示。
   5 人员要求
  （1） 经有资质的单位培训，考试合格取得上岗证后持证上岗。
  （2） 专业主管为本科以上学历和中级以上职称，三年以上工作经历。
  （3） 工作人员有专业技术职称。
  （4） 培训单位须由省卫生厅指定，部临检中心认可。
   6 硬件要求
  （1） 实验室面积不小于40平米。
  （2） 4个分区（扩增检测一体可合并3、4区）。
  （3） 具备相应的仪器设备。
  （4） 具备防污染条件。
   7 软件要求
  （1） 仪器设备的维护保养程序。
  （2） 仪器设备的校准程序。
  （3） 仪器设备的操作程序。
  （4） 临床标本的收集程序。
  （5） 临床标本的处理（核酸纯化）程序。
  （6） 核酸扩增及产物分析检测的操作程序。
  （7） 试剂的质检操作程序。
  （8） 消耗品购置验收和储存程序。
  （9） 废弃物的处理程序。
  （10）内务管理程序。
  （11）室内质量控制程序。
  （12）抱怨处理程序。
   8 监督管理
  （1） 省临床检验中心对临床基因诊断实验室进行质量监督，采取不定期
   抽查方式进行现场检查，抽查不合格者予以警告、限期整改直至取消合格证。
  （2） 对无合格证和被撤消合格证的单位，如仍开展临床基因实验诊断收费项目，将由卫生行政部门在媒体公告并给予查封实验室及经济处罚。
   9 出现下列情况之一的实验室将被责令停业并对其所在的医疗机构予以公告：
  （1） 擅自开展超出验收合格并备案的检测项目。
  （2） 使用未经国家SDA批准生产的试剂。
  （3） 未开展室内质量控制。
  （4） 未开展室间质量评价活动。
  （5） 在检测中弄虚作假。
  （6） 以科研为目的的项目向临床出具报告并向病人收费。
  （7） 从事检测的人员无证上岗。
   10 室内质控
   PCR检测包括标本采集、核酸提取、基因扩增、产物检测等步骤，每个步骤都应有相应的质控措施。其中最关键的是标本采集和核酸提取。
  （1）标本采集和保存总的原则
   A．规定标本采集的时间：这样既便于病人做好准备也便于检验人员做好准备，集中收取标本及时检测。尤其是检测RNA的标本，应在标本采集后及时进行处理。否则RNA会很快降解，影响检测结果。
   B．规定标本的类型和数量：应根据不同类型的疾病以及病程的不同阶段，收集
不同类型的临床标本，并规定应采集标本的数量。
   C．标本应装在封闭的无菌容器内。
   D．标本的标识应是唯一的，不能混淆。
   E．迟送标本，标本量不足及其他未按规定采集的标本应拒绝接受。
  （2）潜在的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估计，好的DNA提取物，A260/A280 比值应该在1.75～2.0之间；否则，污染（残留的蛋白或酚）可能会很高。仅用光度计比色方法难以对DNA的完整性下结论。通用琼脂糖凝胶电泳来检测，可知所提取的DNA是否发生降解并确定DNA提取试剂的质量。

表4  常见的全自动核酸纯化仪

  IsoQUICK                       Orca Research, Inc., Bothell,WA
  Biorobot 9604                  Qiagen, Inc.,Chatsworth, CA
  ABI PRISM 6700                 Applied Biosystems, Foster, CA
  NucliSense Extractor           Organon Teknika Co.
  MagNA Pure LC                  ROCHE
  COBAS AmpliPrep                ROCHE
    11  室间质评
   （1）可参加部级、省级临检中心的质评计划。
   （2）接受省临检中心的现场调查。
   （3）一个质评项目连续二次成绩不合格，整改并暂停项目收费活动三个月。
    12  所有实验的原始资料均应存档；所有的记录均应规范登记在册；原始登记表应记录试剂来源、批号；质控血清的来源及测定值并注明是否在控；签上实验者姓名及审核者姓名。
    13  如试验结果对临床诊断有决定意义，其样本应保留，至少与病历保存期一致。

摘自：《临床检验杂志》2002年8月第20卷 特刊