1999年7月,在美国旧金山召开的第52届AACC年会开幕式上,作为纽约Aaron钻石AIDS研究中心主任和首席执行官员、一位HIV-1动态复制特性和HIV感染后机体免疫反应的专家,DR HO.作了重要发言。他说:"尽管HIV的科学研究步伐已经相当快了,但还是无法跟上其破坏速度。"可见,对HIV的早期检测、预防和治疗迫在眉睫。然而,近来的研究提示,不作为完全治愈的治疗性控制是可以达到的。此外,科学家们也一直在研究HIV疫苗。

    获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS）是一种由病毒引起的全身性传染病,其定义是血液中查到人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)抗体或其它相关的病毒学指标,机体抵抗感染和疾病的免疫机能受到破坏,而发生一系列相应症状。HIV感染者的定义是血液呈HIV阳性而无症状的感染者。

一、流行病学

    1981年6月5日美国疾病控制中心(CDC)的《发病率与死亡率》周报(Morbidity and Mortality Weekly Report, MMWR)揭开了AIDS历史性的第一页。去年联合国艾滋病计划署以及世界卫生组织指出,近10年来,全球感染HIV的人数不断增加,预计今年将再有560万人感染此病,非洲的感染情况最严重。如今艾滋病已成为全球第四大杀手,夺去了超过1600万人的生命。单是去年,便有220万人死于此病,预计今年死亡人数会达到破纪录的260万。今年统计数字显示,目前有3360万人感染了HIV(其中120万是儿童),比去年增长0.6%。相对于非洲及欧美国家,亚洲受到艾滋病的威胁较迟,但亚洲人感染艾滋病的增长速度却非常快,而且越来越多的年轻人感染HIV。

    中国艾滋病的近况:全国AIDS的流行经过三个阶段。一、散发期(1985-1988年),85年在浙江杭州有首例报道,后又在北京发现。二、局部流行期(1989-1995年),89年在我国沿海和边疆(如云南省)及归国人员中检测出有HIV感染。三、泛滥期,95年,我国大部分地区都已发现HIV感染者。97年仅青海省没有发现,98年青海省也报道了HIV。至此,全国31个省、市、自治区全部发现了HIV感染者。

    全国HIV感染者报告人数已超过2万3千例,病例880例,死亡466人。感染人数超过60万。2001年8月28日,《健康报》报道了一篇"走进艾滋村"文章,报道河南省上蔡县文楼村由于不规范单采血浆而造成HIV感染而成为艾滋村。去年,武汉市也对2001年当地发现39例新增HIV感染者、人数超过此前感染者总和作了报道。据专家估计,到年底,该市HIV感染者人数将达到1500余人。最近世界卫生组织代表指出:"中国应该清醒面对艾滋病危机"。

二、生物学特征

(一)发展简史

    1983年,法国巴斯德研究所分离到一种新反转录病毒,命名为淋巴腺病相关病毒(Lymphadenopathy Associated Virus, LAV)。1984年美国国立癌肿研究所也分离到该病毒,命名为嗜人T淋巴细胞Ⅲ型病毒（Human T-cell Lymphotropic Virus Type Ⅲ,HTLV-Ⅲ）。同年,美国加利福尼亚州大学分离出AIDS相关病毒(AIDS Related Virus, ARV)。1986年,国际微生物学会及病毒分类学会将这些病毒统一命名为HIV。

(二)HIV结构与蛋白质功能

    HIV呈球型或卵型,直径为100-120nm,系双层结构。核心由两个相同拷贝的RNA及蛋白质、反转录酶、核糖核酸酶及整合酶组成,核心外为病毒衣壳,20面体立体对称,有蛋白质(P17/P18、P24/P25)。病毒最外层为膜蛋白。包膜上有刺突,含糖蛋白gp120,在双层脂质中有gp41。

    核心蛋白(gag)、包膜蛋白(env)和聚合蛋白(pol)是HIV的三种结构蛋白。所有核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白体上,P17位于核蛋白与壳层之间的基质上,包被于包膜蛋白的内部。P24和P15构成核衣壳的外衣,包被于内部核酸的外围,故核衣壳主要为P24。包膜蛋白为糖蛋白,gp160是前体分子,在感染初期产生,然后分解成gp120和gp41。聚合酶蛋白包括P66`P51和P31,它位于病毒的核区内,并与病毒核酸紧密相关。其功能为:转录病毒RNA为DNA,整合病毒DNA到宿主细胞的DNA上并切割前体分子使之成为有活性的小分子。

    在HIV病原特异性中,HIV-1具有不同的亚型,可分为三大组,即M、0、N组。M组又包括A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个亚型,加上0、N型共12个亚型。0型在非洲、欧洲数例,B型传播范围大,其次C亚型(中国)还有B、C混合亚型,E与J亚型不单独出现,与其他亚型同时出现。HIV-2至少有A-F 6个亚型。HIV亚型的特点:各国家和地区有相对优势亚型,同一亚型差异很大,如上海C亚型与印度C亚型不一;亚型内的变异水平可估算存在时间;不同亚型传播途径和致病性不一;不同亚型对抗-HIV药物引起耐药不同;HIV亚型在流行病学、诊断、临床、试剂选择、药物筛选和疫苗研制上颇为重要。

三、致病机制

    首先HIVgp120竣基端保守区与CD4分子的V1区高亲和力地结合,改变了gp120与CD4分子构型,HIV RNA必须在一种辅助因子帮助下才能进入TH细胞。

    当HIV进入机体后,

    ①HIV借助CD4受体结合到靶细胞表面,通过靶细胞的内吞作用和gp41的融化作用,穿透其细胞膜,又进入细胞质。

    ②在RT作用下,经脱衣壳裸露出病毒RNA,第1条RNA转化成DNA,继之以第1条为模板,形成前病毒。

    ③在整合酶的作用下,形成的双股DNA整合到宿主细胞中,感染就持续存在。

    ④前病毒成为潜伏状态。

    ⑤前病毒DNA复制,具有新一代病毒的遗传物质。

    ⑥复制好的新病毒颗粒,再感染别的细胞,而原感染细胞死亡。

    由于CD4受体首先在T4淋巴细胞上发现,T4淋巴细胞在致病过程中最易受HIV感染。但这种受体也见于其他细胞,在临床上可引起广泛的免疫功能缺陷和广泛的机体损害。为什么HIV如此难以捉摸?主要面对两个障碍:一是当病毒被药物压制并控制时,它们仍保持了很小的复制,不能完全使其停止。二是HIV除了经常反复以外还存在一个会导致潜伏的次要途径。也就是说,HIV"藏"在某些可以长期存活的静止T细胞中。这种特殊的储藏是很难除去的。

四、感染过程

    从一个人感染上HIV到相应的抗体产生,这段时期常称为"窗口期",产生抗体的过程称为血清阳转。一般在一月后开始产生,平均为45天,称为急性感染期。在急性感染期,病毒复制明显,其血液常可出现

    P24抗原和HIV RNA,也可培养到HIV。进入第二阶段潜伏期,潜伏时间短至数月,长至17年以上。难以从其血液中分离出HIV,仅能检出HIV抗体,但确实有低浓度HIV在体内复制。由于病毒在体内不断复制,造成机体免疫系统细胞破坏,开始发现外周血液中T4淋巴细胞数减少,容易产生各种感染倾向。最后,HIV感染发展至AIDS 临床阶段,由于体内免疫系统严重破坏,出现机会性感染和继发性肿瘤。

五、感染后的免疫反应

    在感染初期,血液中首先出现病毒血症,可检出HIV和HIV RNA,也能查到P24抗原。在经过感染后的窗口期,则在血清中查出多种结构蛋白引起的相应抗体,如P24、P55、gp160、gp120、gp41、P51等等,这些都是IgG的抗体反应。关于抗-HIV IgM,理论上在HIV感染时,机体都有IgM抗体反应,但实际上出现的峰度很低,持续时间也短。

   病毒蛋白:抗gag抗体,如P24、P17抗体是常规筛选和确认试验最早检出的抗体。在多数个体中,早期仅有P24抗体出现。

   随着HIV感染的发展,一般均会出现血液淋巴细胞下降,首先出现CD4细胞减少,CD8早期可能会有所增加,且可持续一段时间。CD4细胞数目是在临床上反映其疾病最重要的指标之一,已被广泛应用于评价疾病的临床进展程度。HIV无症状感染者在潜伏期末有50%出现CD4细胞下降,几乎所有有症状的AIDS病人或AIDS相关综合征患者有CD4细胞下降的表现,CD4和CD4细胞比值也十分重要,还有其他一些可用于评价免疫功能的细胞学指标,HIV感染者β2-微球蛋白(β2m)和新蝶呤水平升高并与其病程有关。

六、HIV的实验诊断

   1.HIV病毒培养与分离:采集HIV感染者或对AIDS病人外周血单核细胞进行培养,然后测定病毒培养上清液中HIV RT或P24抗原。可提供初期感染和AIDS阶段的诊断依据。

   2.HIV毒株分析:不同毒株感染免疫系统的不同靶细胞,M细胞群和T细胞群,两大类毒株群可以通过测定表型基因序列而加以确定。

    3.HIV核酸测定:每毫升人体血液中检出病毒核酸拷贝数来表示。主要采用基因扩增(PCR)和分枝DNA信号扩大系统(bDNA)两大类来判定血浆或血清中HIV颗粒的含量。

    4.P24抗原的测定:由HIV感染的动态学研究可知,HIV感染机体后,病毒在体内繁殖直至剌激体内产生抗体,一般约需一至两周的时间,在此期间检测不出抗-HIV抗体,即为HIV感染的窗口期。输用窗口期的血,存在输血后HIV感染的可能性。故P24抗原测定比抗体检测时间提前约一周,可作为初期感染窗口期的早期诊断、母婴传播HIV的早期诊断、献血员筛选、监测疗效和疾病预后的评估。一般采用双夹心法的酶免疫技术。

    5.HIV抗体测定:HIV抗体一般在人感染HIV后2-3个月出现,可延续至终身,是重要的感染标志,抗体测定必须区分初筛和确认两个步骤,目前常用的初筛实验方法为第3代ELISA试剂,其敏感性和特异性均可达99%以上。如:

    A.抗体筛选酶免试剂,其特点是:

    ①应用独特的IgG和IgM捕捉模型,用特异抗原检出,达到极高灵敏度。

    ②在重组融合蛋白基础上,再加多肽使其有广泛的检出位点。

   ③特有的0亚型重组抗原,以确保测得0亚型。

   B.双抗原夹心酶免试剂:用HIV-1/2抗原包被酶标板,若标本中有HIV抗体存在,包被的抗原与标本中的抗体及相应的酶标抗原形成复合物,并通过显色剂TMB显色,来检测标本中是否带有HIV抗体。随着基因、重组技术的进步,试剂盒的制造有了很大进步。(见表)

    合成肽来源稳定，固相自动化合成，有良好的重复性;多肤中包含若干个抗原决定簇,大大提高了检测灵敏度,缩短了窗口期。

    C.快速试剂:可采用间接法和双抗原夹心法,以胶体金或胶体晒标记。

    艾滋抗体1+2型加0亚型(全血/血清/血浆),可用于急诊手术,紧急输血,事故紧急检测(就地检测POCT);母婴筛选,性及吸毒犯罪人员体检;极少量HIV样本实验室,偏远地区,外出检测携带方便,结果可保存。

   现已发展到抗原加抗体联合检测第四代试剂,包被和标记的分别是HIV 1/2 O抗原和HIV-l P24抗原的单克隆抗体,可同时检测HIV抗原和抗体,检出时间提前大约七天。

   HIV抗体确认试验目的是排除初筛的假阳性。有多种方法,如免疫荧光法(IFA),放射免疫分析法。目前主要应用免疫印迹法(Western Blot, WB),在特定条带上出现蛋白反应,以判断阳性与否。

    我国判定标准:

   (1)HIV抗体阳性:至少有两条膜带(即gp160/gp120/gp41)和至少有一条膜带和P24(核心)带同时出现。

   (2)HIV抗体阴性:无HIV抗体特异性带出现。

   (3)HIV抗体可疑:出现HIV特异性抗体带,但带型不足以确认阳性者。

   6.HIV-1病毒载量(Viral load)HIV-1病毒载量是指体内复制的病毒数量,一般以血浆HIV RNA的拷贝数表示。目前对病毒载量测定的方法学:

   ①逆转录多聚酶链反应(RT-PCR);

   ②分枝DNA信号扩大系统(bDNA):带有侧链的分枝DNA片段起信号放大作用;

   ③核酸序列扩增系统(NASBA):等温RNA扩增系统。

   其意义在于:①早期诊断:检测HIV RNA可以使窗口期缩短至大约1周。可用来追踪HIV的自然感染史,可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒序列,这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV的传播性。②用于预测疾病的进程和监测疗效,监测长潜伏期(4-7年)、抗病毒治疗期间以及有效的抗病毒治疗后病毒的水平;也可用于HIV-1血清型阳性母亲的婴儿的HIV检测。③判定母婴垂直感染与否:在婴儿出生后最初的6-9个月期间,他们的血液中存在母体的抗体,因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。

   7.HIV亚型分析:这主要是针对HIV-1毒株不同亚型而进行的测定。目前我国已发现至少有A、B、C、D、E、F　6个亚型,主要采用分子杂交试验。

   8.HIV变异的识别:主要是测定基因序列,从而判断病毒变异。

   9.细胞因子的测定:HIV感染人体后的主要靶细胞是CD4淋巴细胞(当然也累及其他细胞)随着病情的演变,HIV复制加快,尤其在AIDS 临床阶段,其在淋巴结中每天复制达100亿个左右,且大量释放到血循环中,使更多的免疫细胞与其也细胞被感染上,引起每天被破坏的细胞数以百万统计。大量细胞遭到破坏,CD4淋巴细胞数也急骤下降,使免疫系统严重被破坏。在测定CD4淋巴细胞时,测定CD8淋巴细胞,CD4与CD8的比例通常为2:1,如果比值<1,意味着免疫状况不佳。比值越低,则细胞免疫缺陷愈加严重。

   HIV感染标志分为病毒标志、免疫标志和相关标志三大类。病毒标志是指直接从HIV感染者体内分离出病毒或检出HIV组分(抗原或核酸)。免疫标志是指HIV感染所产生的HIV抗原、抗体等免疫物质。相关标志是指与HIV感染、艾滋病病情进展有密切关系的某些标志,如CD4细胞、CD8细胞,β2微球蛋白、有关细胞因子等。这些标志的测定可为HIV感染及临床疗效的考核提供极为重要的诊断、治疗和预后指征。目前HIV抗体的检测是艾滋病原检测中最常用的方法,因为HIV抗体是患者感染HIV后最容易检出并且持续时间最长的免疫学标志,而且抗体的检测方法

   大多简便、经济,易于推广应用。在此祝贺上海科华生物工程股份有限公司研发并生产出第三代双抗原夹心法HIV 1+2型抗体酶联免疫法诊断试剂盒，且其研制成功的测定HIV P24抗原诊断试剂盒也已获得新药证书，为攻克艾滋病做出了贡献。

摘自：检验医学信息网