上海第二医科大学瑞金医院临床医学院 检验系 王鸿利

    卫生部卫医发（2000）412号文件《出、凝血时间检验方法操作规程的通知》（以下简称《通知》）已下达。本文浅谈学习《通知》的体会。供参考。

一、出血时间检验项目为什么不能废除
    众所周知，出血时间(bleeding time,BT)是指刺破的皮肤自然出血到出血自然停止所需的时间。出血时间反映微小血管壁的促血栓形成作用和抗血栓形成作用的平衡，以及血小板的数量与功能是否有异常的一种常用筛选试验。出血时间延长是反映：
（一）血管壁的促血栓形成作用和抗血栓形成作用平衡的失调
 1. 促血栓形成作用的减退
（1）血管收缩作用的降低：血管壁受自主神经支配，当自主神经张力增强，血管壁收缩，血流减慢，有利于止血。此外，血管内皮细胞分泌内皮素-1（ET-1）、α-肾上腺素系统以及血小板释放血栓烷A2（TXA2）、5-羟色胺（5-HT）等都可使血管收缩，限制受损血管的出血。当血管收缩作用减低，致出血时间延长。
（2）促血栓形成物质减少：内皮细胞分泌血管性血友病因子（vWF）、纤粘蛋白（Fn）和外连素（Vn）等粘附蛋白，它们参与血小板粘附或凝集。损伤血管壁暴露胶原，它参与血小板粘附和内源凝血系统的激活；释放组织因子（TF），它参与外源凝血系统的激活。当促血栓形成物质减少，可致出血时间延长。
 2. 抗血栓形成作用的增强
（1）血管舒张作用增强：血管壁受自主神经支配，当自主神经张力减低，血管舒张，血流加快，增加出血。此外，血管内皮细胞分泌血管松弛因子（EDRF），即内皮细胞衍生的一氧化氮（EDNO）；内皮细胞分泌前列环素 ，它们促使血管舒张，后者还抑制血小板聚集。当血管舒张作用增强，也会导致出血时间延长。
（2）抗血栓形成物质增多：血管内皮细胞分泌肝素类物质，它们结合抗凝血酶（AT）或肝素辅助因子Ⅱ（HcⅡ），能灭活凝血酶等丝氨酸蛋白酶。分泌的血栓调节蛋白（TM）与凝血酶结合激活蛋白C(PC)系统，后者灭活因子VⅢa、Va和抑制纤溶酶原激活抑制物（PAI-1）。分泌的TF受组织因子途径抑制物（TEPI）所抑制。当上述物质增多，出血增加，出血时间延长。
（二）血小板数量的减少和功能的减低
 1. 血小板的数量减少：血小板由骨髓巨核细胞生成，循环中血小板的数量是反映血小板生成与消亡之间的动态平衡。当血小板数量低于70× /L，可见手术或创伤出血增多；当低于50× /L，可有损伤出血增多；当低于30× /L，则有自发性出血倾向。此时出血可以延长。
 2. 血小板功能的减低：血小板有以下止血功能：
（1）粘附：由内皮下组分、vWF和血小板糖蛋白I -Ⅸ-Ⅴ(GPI -Ⅸ-Ⅴ)参与；
（2）聚集：依赖GPⅡ /Ⅲa、纤维蛋白原（Fg）和 ；
（3）释放：ADP/ATP/β-TG/PF /TSP和P-选择素；
（4）凝血：血小板为复合物FⅨa-VⅢa和FⅩa-Ⅴa提供催化表面；
（5）参与血块收缩；
（6）维护血管内皮细胞的渗透性。当上述一种或多种血小板功能减低，出血时间延长。
    综上所述，当上述血管壁和血小板有缺陷（即一期止血缺陷）时，目前只有应用出血时间测定作为筛选试验，故出血时间甚为重要，国内外都未废除。

二、为什么要停止使用出血时间测定项目的Duke法，需要时可使用出血时间测定器法检测出血时间
    目前检测出血时间的方法有：
（1）Duke法（1908年）：参考值为1～3分钟，本法虽然操作简便，但由于干扰因素较多，故缺乏敏感性和准确性。
（2）IVY法（1935年）：参考值2.5～8.5分钟，本法虽较Duke法敏感，但由于操作不易标准化，故结果难以准确。
（3）出血时间测定器法（1969年）：参考值6.9±2.1分钟，由于它是双刀片并加有弹簧装置，刺入皮肤的创口长度和深度均已固定，故其较Duke法和IVY法容易掌握，也较为敏感和准确。
    据报道，一组随机志愿者1300例，用Duke法测定出血时间延长（＞4分钟）者为4例，延长率为0.3%；用出血时间测定器法测定延长（＞9分钟）者为65例，延长率为4.8%。Harker等检测血小板减少患者发现，血小板数越低，IVY法出血时间越长，血小板为75× /L,IVY法出血时间为8.0分钟，50× /L时为10分钟，10× /L时则＞15分钟。瑞金医院检测126例特发性血小板减少性紫瘢（ITP）和20例血管性血友病（vWD）患者的出血时间，结果列于表1。二种方法检测有非常显著差异。
          
表1  ITP和vWD患者两种出血时间检测结果比较

注：Duke法＞4分钟为延长，测定器法＞9分钟为延长；两种方法比较P＜0.001
    由此可见，Duke法出血时间应该弃用，以出血时间测定器法替代。

三、什么情况下使用出血时间测定器法检测出血时间
    现知，出血时间是一期止血缺陷的筛选试验，故临床上存在或怀疑一期止血缺陷时，需使用出血时间测定器法检测出血时间。由于一期止血缺陷常见：
（1）血管壁异常所致出血：血管性血友病（vWD）、遗传性出血性毛细血管扩张症、单纯性紫癜、过敏性紫癜以及其他血管性紫癜等。
（2）血小板数量减少所致出血：特发性血小板减少性紫癜（ITP）、免疫性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、溶血尿毒症性血小板减少性紫癜（HUS）以及各种继发性血小板减少症（急性白血病、再生障碍性贫血、化疗/放疗后、病毒性疾病、肝病、尿毒症等）。
（3）血小板功能异常所致出血：主要常见于血小板无力征（缺乏血小板聚集反应）、巨大血小板综合症（缺乏血小板粘附反应）、贮存池病（缺乏血小板颗粒或释放反应）、花生四烯酸代谢障碍以及获得性血小板功能异常（如肝病、尿毒症、骨髓增生症等）。
（4）血小板数量增多所致出血：原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、慢性粒细胞白血病、骨髓纤维化以及其他血小板增多症等。
（5）药物所致出血：尤其是抗血小板药（阿司匹林、塞氯吡啶）、抗凝药（肝素、口服抗凝剂）和溶血栓药（链激酶、尿激酶）等。
（6）纤溶活性亢进：原发性纤溶症和继发性纤溶症（如DIC等）。
因此，临床上存在或怀疑上述疾病时，需用出血时间测定器法检测出血时间。

四、为什么要停止使用凝血时间测定的玻片法和毛细管法，用活化部分凝血活酶时间（APTT）或全血凝固时间（CT，试管法）进行替代
    凝血时间是指离体血液与异物表面接触到血液自然凝固所需要的时间，它是反映内源凝血系统整个凝血过程的筛选试验。
目前检测凝血时间的方法有：
（1）毛细管法和玻片法凝血时间，参考值分别为3～7分钟和2～8分钟，这两种方法虽然简便，但干扰因素太多，既不敏感，也不准确。
（2）普通试管法凝血时间和复钙时间（再钙化时间），参考值分别为5～10分钟和1.5～3.0分钟，这二种方法，虽较前二种方法为敏感，但也不理想。
（3）活化的部分凝血活酶时间（APTT），参考值为31～43秒，本法较前4种方法为都敏感、简便、快速、实用。
（4）硅管法和活化凝血时间（ACT），参考值分别为16～32分钟和1.14～2.05分钟，这两种方法最为敏感和准确，但操作较繁琐。
    据瑞金医院报道，将检测血友病（因子Ⅷ缺乏症和因子Ⅸ缺乏症）中上述7种凝血时间检测法敏感性的比较，列于表2。
                
表2  7种凝血时间检测的敏感性比较

由表2可见：
（1）毛细管法和玻片法凝血时间，虽然操作简便，但很不敏感，仅能检测出重型血友病中因子Ⅷ:C或Ⅸ:C水平＜0.15%的患者，故建议淘汰，不能再用。
（2）普通试管法和复钙时间虽然较毛细管法和玻片法为敏感，但也只能检测出因子Ⅷ:C或Ⅸ:C水平在＜2%或4%的患者，可以保留，但建议不能用于血友病的诊断和肝素的实验室监测。
（3）APTT、硅管法凝血时间和ACT，均为敏感性试验，但由于APTT简便、快速、实用，市场上又有试剂盒提供，还可用多种血液凝固分析仪测定，故建议以APTT代替其他凝血时间，可在临床上广泛应用。

五、为什么要停止使用一般外科手术前的常规出血时间检测，用APTT、PT和PLT联合检测取代
（一）术前止血功能评价的试验
    无论对术前已知出血缺陷或未知出血缺陷的患者，都需进行活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆凝血酶原时间（PT）和血小板计数（PLT）等三项联合检测。着重指出，有出血的家庭史或个人史，怀疑有血管壁功能异常或血小板功能缺陷时，还必须加做出血时间测定器法检测出血时间。
 1. 活化部分凝血活酶时间（APTT），它是反映内源性凝血系统的常用筛选试验。单纯APTT延长见于：
（1）先天性内源凝血系统缺陷：主要是血友病A、血友病B和因子Ⅺ缺乏症，其次是因子Ⅹ、Ⅴ、Ⅱ和纤维蛋白原缺乏，再次是因子Ⅻ、激肽释放酶原（PK）和高分子量激肽原（HMWK）缺乏等。
（2）血循环中有抗体存在：特别是因子Ⅷ抗体，其次是因子Ⅸ、Ⅺ抗体等。
（3）严重肝脏疾病：除因子Ⅷ以外，内源凝血系统各凝血因子的血浆水平可因合成减少或消耗增多而降低。
（4）弥散性血管内凝血（DIC）：内源凝血系统的各个因子均可由于消耗增多而减少。
（5）抗凝和溶栓治疗：临床应用肝素、口服抗凝剂或溶血栓药物治疗时，APTT可延长。
（6）血管性血友病（vWD）：APTT可延长、因子Ⅷ:C可减低。
 2. 血浆凝血酶原时间（PT），它是反映外源凝血系统的常用筛选试验。单纯PT延长见于：
（1）先天性外源凝血系统缺陷：主要是因子Ⅶ、Ⅹ、Ⅴ、Ⅱ和纤维蛋白原缺乏。
（2）口服抗凝剂（华法令、新抗凝、双香豆素等）：要求使用国际敏感度指数（ISI）＜2.0的试剂，稳定国际标准化比率（INR）在2.0～3.0。
（3）获得性外源凝血系统缺陷：如DIC、肝病、溶栓治疗和外源凝血系统抗体存在等。
 3. 血小板计数（PLT），它是反映循环中血小板生成和消亡之间平衡的试验，也是临床上最常用的试验之一。
（1）血小板减少：见于原发性（特发性血小板减少性紫癜）和继发性（急性白血病、再生障碍性贫血、MDS、病毒性感染、化疗和放疗后）。
（2）血小板增多：见于原发性（原发性血小板增多症）和继发性（真性红细胞增多症、慢性粒细胞白血病、骨髓纤维化、急性感染、急性出血、急性溶血等）。
（3）血小板正常：临床有皮肤、粘膜出血表现者，多应考虑血管壁异常（如vWD等）和血小板功能异常（如血小板无力症等）。
（二）筛选试验的结果判断
 1. 一期止血缺陷筛选试验的结果判断。一期止血缺陷是指血管壁和（或）血小板异常所致的出血，其筛选试验及结果判断（图1）如下：

（1）BT和PLT都正常：除正常人外，多数是由于单纯血管壁通透性和（或）脆性增加所致的血管性紫癜。临床上常见于过敏性紫癜、遗传性出血性毛细血管扩张症、单纯性紫癜、机械性紫癜、老年性紫癜、类固醇性紫癜、Ehlers-danlos综合征以及异常蛋白血症所致血管性紫癜等。
（2）BT延长伴PLT减少：多数是由于血小板数量减少所致的血小板减少性紫癜。临床上多分为原发性和继发性两种，后者常见于再生障碍性贫血、急性白血病、放疗和化疗之后、弥散性血管内凝血（DIC）、脾功能亢进、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）和溶血尿毒症综合症（HUS）等。
（3）BT延长伴PLT增多：多数是由于血小板数量增多所引起的血小板增多症。临床上多分为原发性和继发性两种，后者常见于慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症、骨髓纤维化及严重感染、急性溶血、严重创伤和广泛性大手术等。
（4）BT延长伴PLT正常：多数是由于血小板功能异常或某些凝血因子缺陷所引起的出血性疾病。血小板功能异常多见于遗传性和获得性血小板无力症，致密颗粒缺陷症、α颗粒缺陷症和血小板第3因子缺陷症等。某些凝血因子缺陷症主要是血管性血友病（vWD）、低（无）纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症等。
 2. 二期止血缺陷筛选试验结果判断。二期止血缺陷是指凝血障碍和抗凝血物质存在所致的出血性疾病，其筛选试验及结果判断（图2）如下：

（1）APTT和PT都正常：除正常人外，仅见于遗传性和继发性因子ⅩⅢ缺乏症。获得性者由于严重肝脏疾病、肝脏肿瘤、恶性淋巴瘤、白血病、抗因子ⅩⅢ抗体、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血等引起。
（2）APTT延长伴PT正常：多数是由于内源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病，如血友病A、血友病B、因子Ⅺ缺陷症；血循环中有抗因子Ⅷ、抗因子Ⅸ或抗因子Ⅺ抗体存在；DIC时可见因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ降低，肝脏疾病时可见因子Ⅸ、Ⅺ减少，口服抗凝剂时可见因子Ⅸ降低、血管性血友病（vWD）等。
（3）APTT正常伴PT延长：多数是由于外源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅶ缺陷症，获得性者常见于肝脏疾病、DIC、血循环中有抗因子Ⅶ抗体存在和口服抗凝剂等。
（4）APTT和PT都延长：多数是由于共同途径凝血缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅹ、Ⅴ、凝血酶原（因子Ⅱ）和纤维蛋白原（因子Ⅰ）缺陷症，获得性者主要见于肝脏疾病和DIC，口服抗凝剂时可有抗因子Ⅹ、抗因子Ⅴ和抗因子Ⅱ抗体存在时，它们也相应延长。临床应用肝素治疗时，APTT和PT也都会延长。
    总之，对于卫生部的《通知》，我们要认真学习、深刻领会、结合临床、不断实践和善于总结，将我国的检验医学更符合临床的需要。

摘自：Sysmex公司网