深圳市人民医院检验医学部   陈  昕

    基因芯片技术是寡聚核苷酸、基因组DNA、cDNA 或肽核苷酸固定与硅片、玻璃片、塑料片、凝胶或尼龙膜等固相介质上形成基因芯片，再通过激光共聚焦荧光监测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。该技术是伴随近年来人类基因组研究的迅猛发展，基于一种全新的DNA测序方法--杂交测序法应运而生的，它的突出特点是具有高度的并行性、多样性、微型化、多样化。目前，基因芯片技术在医学各个领域中的应用已取得巨大突破。
   一、基因芯片技术的基本原理和步骤
   1、基本原理 基因芯片技术的基本生物学原理就是根据遗传学中心法则，利用基因互补配对原则，在同一载体上同时进行基因检测，即高密度的斑点杂交技术。
   2、基本步骤 基因芯片技术的具体步骤根据其种类和检测目的不同而有所不同，但主要的流程大体相似，包括几方面。
   3、基因芯片的制备 基因芯片的实质是高度集成的寡聚核苷酸阵列，因此制造基因芯片首先要解决的技术问题就是如何在芯片上定位合成高密度的核酸探针。目前，基因芯片的制备主要采用三种方法：
   （1）光蚀刻合成法 该法由美国的 Affymetrix公司首先开发采用，它将半导体工业的光蚀刻技术和DNA合成技术结合起来，利用可感光保护基因修饰芯片片基表面碱基单体的活性羟基，通过设计特定的光蚀刻掩膜和不断更换曝光区域，直接在片基上合成寡聚核苷酸探针，随着反应的重复，探针数目呈指数增长，形成所需的高密度寡核苷酸阵列，它的优点在于精确性高，缺点是制造可感光保护剂价格较为昂贵。
   （2）压电印刷法 其原理与喷墨打印类似，“打印机”头上有四个墨盒，分别装有四种碱基，“打印机”头在方阵上移动，并将带有某种碱基的试剂滴到基片表面，固定后经过洗脱和去保护，就可以连上新的核苷酸使核苷酸链延伸。其采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂，并且效率较高，但工艺目前仍不成熟。
   （3）点样法 是将预先合成的寡核苷酸、肽核苷酸或分离得到的cDNA通过特定的高速点样机点到芯片片基上。此种方法的优点是成本低、速度快，但是构成方阵的寡核苷酸或cDNA片断需要事先纯化。目前采用该方法的公司最多。
   4、样品的制备 因为生物样品的成分比较复杂，为了提高检测结果的准确性，需要先对样品进行处理。例如来自血液或组织中的DNA或mDNA样本须先扩增，然后用荧光素或同位素标记成探针。
   5、杂交 探针与芯片的杂交主要受时间、温度及缓冲液盐浓度的影响，杂交条件的选择应根据芯片上核酸片断的长短及其检测目的而决定。
   6、并读出杂交图谱 对芯片进行扫描、图像处理和基因表达信息分析，目前最为常用的是激光共聚焦荧光检测系统，此外还有质谱法、化学发光法、光导纤维法等多种检测方法。
   二、基因芯片技术在临床疾病诊断中的应用
基因芯片技术无论从方法上还是临床医学上都是一种全新的思维，为临床检验工作提供了一种全新的技术，使一些临床检验工作中难解决的问题成为可能。
   1、遗传性疾病的诊断 随着人类基因组计划的完成，许多遗传性疾病的相关基因被相继定位，例如肥胖病、老年痴呆症、精神病、高血压病、地中海贫血等。利用基因定位型基因芯片，通过遗传病家谱研究可以将某一遗传病和基因与一种或多种多态性联系在一起，从而在染色体上的合适位点定位出遗传病相关基因，对研究亲代与子代的遗传重组，创造更精确的第三代遗传图谱有重要的价值。
   2、感染性疾病的诊断 伴随病原微生物基因组计划的进展，使基因诊断病原微生物感染成为可能。基因芯片技术不仅避免了繁琐而费时的病原微生物培养，而且不需要等到抗体的出现，为病原微生物诊断提供了强有力的技术手段。
    Hauser等应用DNA芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应之前检测到艾滋病病毒，对该病的早期诊断意义重大。Affymetrix公司和Roche Molecular公司合作，将PCR扩增技术和DNA芯片技术结合检测艾滋病人的HIV耐药反应。Paxtor等应用DNA芯片技术研究艾滋病患者在接受双脱氧腺苷一到两年的治疗后HIV-1反转录酶基因型和对药物敏感度在感染个体中的改变。总之，基因芯片技术在艾滋病的发病机理、诊断、治疗及用药后的监控都发挥了重要作用。此外，基因芯片技术对人巨细胞病毒、肝炎病毒、结核分枝杆菌的诊断及致病微生物的鉴别亦发挥一定作用。
   3、肿瘤的诊断及治疗 基因芯片技术已广泛地用于肿瘤组织与正常组织基因表达在mRNA水平上的差异，为研究肿瘤发生机制提供强有力的工具。目前利用该技术可以对包括白血病、淋巴瘤、皮肤黑色素瘤及乳腺癌等多种肿瘤疾病的肿瘤细胞亚群进行区分，还可以利用该技术对治疗方案进行评估和新药药效评价，此外还能对肿瘤的发生、发展和转归的预测提供分子依据。利用基因芯片技术观察药物对肿瘤细胞基因表达谱的影响，评估药物对肿瘤治疗的可行性，从中筛选出抗肿瘤候选药物，为抗肿瘤药物的研究和开发提供了极具价值的参考资料。基因芯片技术在肿瘤基因研究及临床治疗领域的应用将不但使我们能更快速可靠地对肿瘤进行精确诊断，对其发生的内在分子机理液将有更深入的了解，极大地推动了肿瘤分子病理学的发展。
   三、结语
    基因芯片技术是一种快速、高效的核酸分析手段，它的出现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来新的革命，成为后基因时代最重要的基因功能分析技术之一。但是短期内基因芯片难以在临床上广泛应用，主要是由于：基因芯片技术制备比较困难，因而开发更为简便、成本较低、适合科研人员操作的基因芯片制备技术是当前的迫切任务；商品化的基因芯片价格昂贵，分析检测设备的成本较高也影响了基因芯片技术的广泛应用；另外，目前我们对人体基因功能还知之甚少，基因芯片的优势难以得到发挥，目前的基因芯片只能用于一些分子机理相对清楚的疾病诊治，而且目前还没有对基因芯片的用药指导的耐药基因数据库。但是伴随相关技术的飞速发展，将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集成化形成微型分析系统，即构建微缩实验室是基因芯片研究的一个新的阶段，是基因芯片技术发展的最终目标。

摘自《2002年广东省临床化学学术研讨会论文汇编》