广州铁路中心医院检验科  陈斯泽

    肿瘤的形成是遗传因素与环境因素相互作用的结果，随着分子生物学的迅速发展，人们对肿瘤的认识已经发展到基因水平，发现了许多肿瘤相关基因，并从基因水平对癌症进行诊断，也可以通过检测与癌变有关的基因标记物来判定组织学的良恶性程度，或者检测癌症的进展、恶性化程度以及抗癌药的耐药性等。检测这些基因序列或表达情况的改变，将有利于肿瘤的早期发现和早期治疗，提高生存率，并日益成为临床医生诊断肿瘤分型、提供治疗方案、分析预后的一种重要的辅助手段。
    基因诊断是属于全新内容、全新技术和全新概念的实验室诊断方法，该方法直接探查基因的存在状态及功能，即基因型的改变，可对疾病作出可靠的诊断，又称DNA诊断。基因诊断技术技术主要包括核酸分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、限制酶酶谱分析、单链构象多态性分析以及DNA序列测定、差异显示等技术。上述技术与芯片技术相结合，可用于肿瘤易感基因的检测，肿瘤的分类，肿瘤的早期诊断、预后诊断、预后监测，并为肿瘤个体化和预见性治疗提供依据。

DNA芯片技术概述
    新兴的基因芯片技术在疾病的诊断方面发挥了重要作用，它与传统杂交法相比，具有操作简单、自动化程度高、检测靶分子种类多、成本低、效率高、结果客观性强等突出优点。基因芯片检测基因突变，快速高效。从正常人基因组分离出DNA与基因芯片杂交，得标准图谱，从患者基因组中分离DNA与芯片杂交得病变图谱，比较分析两种图谱，即可得出病变的DNA信息。
    DNA芯片技术是一种大规模集成的固相杂交，即在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接讲多种预先制备DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。根据芯片的制备方式又将其分为两大类：原位合成芯片和DNA微阵列（DNA microarray）。芯片上固定的探针除了DNA，也可以是cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列。因此，DNA芯片又被称为基因芯片、cDNA芯片、寡核苷酸阵列等。
    作为新一代基因诊断技术，DNA芯片的突出特点在于快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等。与传统基因诊断相比，DNA芯片技术具有明显的优势：（1）基因诊断的速度显著加快，一般可于30min内完成。若采用控制电场的方式，杂交时间可缩至1min甚至数秒钟。（2）检测效率高，每次可同时检测成百上千个基因序列，使检测过程平行化。（3）基因诊断成本降低。（4）芯片的自动化程度显著提高，通过显微加工技术，将核酸样品的分离、扩增、标记及杂交检测等过程微型化于同一块芯片内部，构建成缩微芯片实验室。（5）由于是全封闭，避免了交叉感染，且通过控制分子杂交的严谨度，使基因诊断的假阳性率、假阴性率显著降低。

DNA芯片技术在肿瘤基因诊断中的应用
肿瘤的早期诊断  肿瘤的形成是遗传因素与环境因素相互作用的结果，肿瘤的发生、发展及逆转都伴随肿瘤相关基因和肿瘤细胞基因表达谱的改变。现有的DNA芯片技术着眼于以下几个方面进行肿瘤的早期诊断。

1、癌基因与抑癌基因
   与肿瘤相关的基因包括癌基因、抑癌基因及DNA错配修复基因等。当癌基因、抑癌基因发生突变时，癌基因活化，抑癌基因失活，以及其他基因异常不断积累，导致肿瘤发生发展。因此，检测癌基因、抑癌基因中发生的基因突变有利于肿瘤的早期诊断。
    BRACA1基因与人类遗传性乳腺癌和卵巢癌密切相关，该基因最常见的突变包括点突变，小范围的插入与缺失等。1998年Hacia 等用芯片检测了乳腺癌和卵巢癌基因BRCA1 等11外显子，全长3.45kb的突变体，检测的15例病人中，准确率高达99%。阎小君等的研究表明Hp 基因芯片技术很可能会成为胃肿瘤诊断的权威方法和金标准。
    抑癌基因p53是在人类恶性肿瘤中最常见的突变基因，约有60%与人类p53抑癌基因的突变有关。Affymetrix公司已把p53基因的全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，该芯片可检测p53 基因所有编码区错意突变和单碱基缺失突变，它将在癌症的早期诊断中发挥重要作用。

2、肿瘤相关基因表达谱
   某些肿瘤的发生，并非基因结构发生了改变，只是基因表达与调控水平上出现了变化。因此，在RNA水平上对致病基因表达情况进行监测，是肿瘤基因诊断的另一种方式。DNA芯片技术可以平行检测大量 mRNA的种类及丰度，从而在RNA诊断上有很大的优势。恶性肿瘤的发生、发展及实验转归都伴有复杂的基因表达谱变化。DNA微阵列技术为研究这些复杂现象提供了强有力的工具。
    利用肿瘤细胞的基因表达与正常细胞存在明显差别，Wang 等利用含有5766个cDNA的芯片比较正常卵巢组织和肿瘤组织的基因表达变化，发现与正常组织相比，肿瘤组织中295个基因高表达，431个基因低表达。PCR扩增后得到658个基因克隆，其中包括94个核糖体结合蛋白基因，149个线粒体来源的序列（其中包括12个新序列），49个EST和178个未知基因。并发现149个线粒体来源的序列在肿瘤组织中全部高表达，认为可能与肿瘤细胞高的增殖活性相关。另外，在所有差异表达基因中，表达最高或表达最低的15个基因有报道与其它肿瘤相关。这些基因的发现，可作为疾病诊断的新靶标，并对疾病的治疗及预后也有重要意义。

3、肿瘤的分型
    肿瘤的分型在临床上一直处于较困难的状态，因为它一直依赖于生物学特点而没有一个系统、合理的方法，许多形态学相似的肿瘤疾病如白血病的许多亚型、淋巴瘤等都会有相似的临床症状，却需用不同的治疗方法。临床上肿瘤治疗急需解决的问题是针对各型肿瘤进行特异性的治疗，加强用药的效力，减少副作用，因此肿瘤分型技术的发展将会大大加强临床治疗肿瘤的特异性、针对性和有效性。
    急性白血病可出现多种临床症状，给临床诊断和临床治疗带来相当难度，因此Golub等人选择了白血病作为研究实例。他们认为肿瘤分型面临两大难题：肿瘤亚型的发现和分类，即找出人类未知肿瘤亚型和将一些特殊病例归入到人类已发现的肿瘤类型中。研制出一个系统性的可自动分类的检测技术DNA微阵列，将其应用于白血病的分型，此DNA芯片上点有6817个人类基因，用来自38个病人的骨髓样本，抽提RNA，发现6817个人类基因中约有1100个基因和AML及ALL相关，测定后得到大量相关检测数据，包括形态学、免疫学、细胞学等指标，从而可建立一个AML和ALL的数据库，分析其数据，可预先在临床诊断上排除相关组织基因表达的干扰，具有快速、简便、准确和高特异性等优点。在1100个基因中选择50个和AML及ALL相关程度更高的基因，和来源于急性白血病病人的38个样本进行杂交反应。在准确率测试中，临床诊断符合率达到98%，38个样本中有36例被准确归类到AML或ALL，同时用这50基因又对34例白血病样本进行分型，检测成功率达到100%。但在不同实验室检测出现不同的实验结果，说明结果和样本制作有极大关系，所以用此方法册测定时，应首先对样品制备进行标准化。

前景与展望： 在分子水平上肿瘤的发生、发展是多步骤、多基因改变的结果。通过对肿瘤细胞基因组不断地深入了解，相信在不久的将来，运用这些知识可建立新的诊断方法。肿瘤分类会出现以分子机制为基础的功能分类取代传统的形态学分类；并能通过 分子表型对肿瘤的侵袭性、转移性和对不同治疗方案的反应性进行预测。
    一个典型的肿瘤细胞大约有30000个基因单独或联合表达，困难的是如何排除遗传不稳定性和DNA修复时存在的畸变等伴随现象，从而鉴别出肿瘤发生的关键基因。
    虽然DNA芯片技术仍在不断改进，但其基本方法已经确立，主要问题是数据的分析和处理。目前已有多篇文献对微阵列数据的分析方法进行了阐述。完全发挥该技术的作用，需要能够储存微阵列表达数据和管理来自各种来源信息的集中的数据库，这些信息资源正在发展之中。我们相信，随着芯片技术的进一步成熟和成品芯片的大量上市，它在肿瘤基因诊断中将会发挥越来越重要的作用。

 摘自《2002年广东省临床化学学术研讨会论文汇编》