泰山医学院附属医院检验科         李和楼
　　　　　　　　

    摘要：目的   建立一种能适合各级实验室常规和急症检测HCO3-的方法。方法   应用自配双试剂建立了二步终点测定法，可同时满足全自动和半自动手工测定，用日立7060生化仪对本方法进行方法学评价。结果    本法比色液吸收峰为558nm，线性范围可达50mmol/L，批内CV3.45，批间CV4.88，平均回收率102.3，与血气分析仪(X)相关良好，Y= 1.0059X-  0.1038，r =0.9813 (n=60)，黄疸、脂血、溶血标本对结果无影响，健康人静脉血HCO3-浓度21~31mmol/L。结论   本法具有操作简便、灵敏准确、试剂稳定、成本低廉等特点，可适合各级实验室应用。                                              　　　    
 
   关键词：酚红比色法；碳酸氢根；双试剂

    血清碳酸氢根测定为临床常用检验项目，是判断酸碱平衡紊乱的重要指标。测定的方法虽较多，但都存在一定的不足，如电极法、酶法结果虽然准确，但因仪器和试剂成本较高而难以普及；滴定法操作简便，成本较低，但准确性和重复性欠佳，试剂不稳定，批量测定费时费力。双试剂酚红比色法是我们根据 H—H方程测定血液pH的原理而建立的一种全新测定法，在日立7060全自动生化仪上经过二年多的常规应用，结果较满意，现报道如下。        

1   原理    
   根据  H—H方程，pH的高低主要取决于血清HCO3-与PCO2的大小，当待测血清和标准液与第一测定试剂混合经过搅拌、加温后，血清中以物理形式存在的CO2逸出，此时比色液的PCO2维持在一个较低水平（约0.3kpa左右），显色液pH的高低则主要取决于血清浓度。用第二试剂酚红显色，其吸光度在558nm与血清HCO3-浓度成线性关系。   　　　　　　　　    

2  材料和方法   　　　　　　　　　　　　　　　　　                        
2.1  试剂      采用自配液态双试剂。　   　　　　　　　　　　　　　　　　　　
2.2   标准液    25.0mmol/L的碳酸氢钠缓冲溶液。其主要血气指标和正常人采血二小时后分离的血清的血气结果基本一致。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
2.3 仪器  HITACHI  7060自动生化分析仪、康宁840血气分析仪、Beckman700半自动分析仪、岛津CL750型分光光度计。                             　　　　　　　　　　 
2.4 方法   自动分析参数 反应类型：两点终点法；反应温度： 37 。C；主波长546nm，次波长不设；孵育时间600  s；标准20μl，样品20μl；试剂R1   240μl；R2  60μl；第一点读数300 s，第二点读数600s（读数点16、31）；两点线性校正。空白吸光度测定：仪器于测定开始加入蒸溜水与R1混合，在  300s时测定第一次吸光度(AR1) 后加入R2，600 s 时测定AR2；同样，仪器加入标准液S(或待测血清M) 与 R1混合，在300 s测得AS1 (AM1)，加入R2后在600s时测得AS2   (或AM2)。    
计算    空白吸光度(AR)=AR2-AR1，标准液吸光度(AS)=AS2-AS1，样品测定吸光度    (AM)=AM2-AM1。                                            
血清HCO3-浓度（mmol/L ）=AM-AR/AS-AR×25.0              　　　　　　　　      

3实验结果                      　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    
3.1  吸收曲线    取NaHCO3标准液和正常血清标本按二步手工法操作，用岛津CL750型分光光度计作吸收光谱曲线，结果显色液（红色）吸收峰在530nm~570nm，最大吸收峰为558nm，试剂空白（黄色）在此波长范围吸光度几乎为零。　　　　　　　　　　　　　　　　
3 .2   线性测定   配制浓度分别为6.9、18.1、26.1、35.5、50.1mmol/L的   NaHCO3标准液，其反应液的吸光度分别为 0.0754、0.207、0.288、0.378、0.563。一元线性回归方程  Y=0.01384X-0.07804(Y为吸光度，X为浓度)，r =0.9999，p＜0.001。本法在50mmol/L内线性良好。
3.3  不精密度测定   取低中高不同浓度的血清标本，用7060分析仪各测20次，结果 x± s分别为16.7±0.79 mmol/L、25.88± 0.94 mmol/L、38.91±0.79mmol/L，CV分别为4.74、3.60、2.03，平均3.45。用日本第一化学生产的室内质控血清和自配的中、高两种浓度的标准液每天测一次，连测20天，结果 x ± s分别为11.23± 0.76mmol/L、26.32±1.18 mmol/L、39.12±1.32mmol/L，CV值分别为6.79、4.48、37，平均4.88。  　　
3.4 回收率测定  在加有1.0ml 混合血清的a、b、c、d 4支试管中，分别加入0.1ml蒸溜水、含18.9mmol/L的混合血清、29.5mmol/L的标准液、55.1mmol/L的标准液，用7060生化仪各测 3次，取均值，测得 4管的浓度分别为27.7mmol/L、30.8mmol/L、32.6mmol/L、37.7mmol/L。b、c、d  3管回收率依次为98.4、99.6、108.9，平均102.3。      
3.5  对照试验   本法(Y)与血气分析仪(X)对照检测标本60例，浓度范围3.7mmol/L~ 41.1 mmol/L，结果酚红比色法  x±s为24.42±5.29mmol/L，血气法 x±s为24.38±5.16mmol/L，经配对 t 检验， t =0.2678，P＞0.05，二种方法无显著性差异。直线回归方程Y=1.0059X-0.1038， r=0.9913。
3.6 干扰试验  本法由于采用双试剂，全自动测定时能够自动消除标本空白的影响。故高胆红素、重度脂血、溶血标本对结果均无干扰，与血气分析仪的测定结果一致。但用手工法操作时一定要减去标本空白管的吸光度。常规用量的肝素防凝血浆对结果无影响。
 3.7   试剂稳定性   用一年前配制室温存放的反应试剂与新配的试剂同时测定20份标本，结果基本一致。                                               　　　　　　　　　　  
3.8   显色液稳定性    本法显色后10分钟内色泽较稳定，10分钟后血清标本管和标准管逐渐同步加深，6小时后色泽稳定，手工测定时应在10分钟内完成比色测定。  　　     
3.9   标本放置不同时间对结果的影响    10份正常人血清标本分别在30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时时用本法和血气分析仪同时测定，结果随着标本放置时间的延长，血气法测得浓度逐渐下降，本法则升高，但 4小时内结果的差异无显著意义，与文献报道的实验结果一致。[1]                          　　　　　　　　　　　      
3.10    参考值     测定 61例健康成人静脉血血清（男33例，女28例，年龄18~65岁），参考范围（x±1.96s）： 21.19~31.25mmol/L。                               

4     讨论                  　　　　　　　　　　　　　　　　　            
4.1   本法所用指示剂酚红是弱有机酸，酸型分子(HIn)呈黄色，碱型离子( In-)呈红色，H-H方程式为PH = PKIn+ log[Hn-]/[HIn]，它表明在给定温度，离子种类和离子强度等条件下，PKIn值恒定，碱型离子与酸性分子之比值及其相应的颜色取决于所在介质的PH。酚红在PH大于PK+3.0(＞11.0)或小于PK-3.0(＜5.0)的介质中，分别全部变成碱型或酸型。碱型吸收峰在558nm，酸型吸收峰在430nm，558nm测得的吸光度仅代表  In-的浓度，且  In-的浓度与吸光度成直线关系。[2]                    　　　　　　　　                
4.2   目前，测定血清的常规方法主要采用滴定法，少数实验室采用酶法或电极法。滴定法虽为WHO推荐的方法，但结果的准确性及重复性较差，标本溶血、黄疸、脂血、终点颜色观察误差、混匀方式及程度等因素均可影响测定结果，试剂不易保存，0.01mmol/L NaOH浓度需经常校正。电极法虽结果准确、重复性好，但仪器昂贵，难以普及应用。酶法是目前唯一能同时用于全自动和半自动测定的方法，但酶法多为干粉单一试剂，复溶时所用蒸溜水的PH、试剂瓶口径大小不同、样本空白等均会对结果产生影响[1]，复溶后试剂不易保存，且酶试剂成本较高，一般实验室难以常规应用。酚红比色法[3,4,5]与其它测定法比较有如下优点：①试剂稳定、成本低廉。本法反应试剂全部采用液体试剂，室温至少可存放一年。新配的标准应用液各项血气指标与正常人抽血2小时后的血气指标基本一致，从而保证了结果准确可靠。②灵敏准确、精密度高。酚红比色法与血气分析仪测定结果高度相关，平均回收率   102.3，批内CV平均 3.45 ，批间CV平均4.88，比WHO要求的滴定法RCV＜20，OCV＜10要小得多[6]。③可适合各级实验室常规和急症检测应用。为适合各级实验室常规和急症检测，我们建立了单一法[3]和双试剂二步法。前者适合基层单位，比色仪器可用半自动或各型分光光度计，后者适合标本量大，设备较好的县级以上单位应用。