王箐舟 王威 程雅琴 陈唯*
（中国药品生物制品检定所，北京，100050
* 执信医疗北京公司）

[目的] 网织红细胞法测定rHuEPO体内生物学活性的改进--R-500全自动网织红细胞分析仪法取代显微镜计数法。
[方法] 用两法分别对20批rHuEPO制品进行测定
[结果] 经统计学配对t检验，两法差异无显著意义。
[结论] R-500全自动网织红细胞分析仪法可以取代显微镜计数法进行rHuEPO体内生物学活性的测定。

关键词：rHuEPO网织红细胞 体内生物学活性 R-500全自动网织红细胞分析仪

    重组人红细胞生成素rHuEPO是一种刺激红细胞生成的活性糖蛋白，临床上主要用于治疗慢性肾衰造成的贫血。RHuEPO的体内生物学活性是制品的最关键质控指标之一，其检测方法采用网织红细胞法。本文用R-500全自动网织红细胞分析仪取代显微镜计数的方法，使实验操作更加简便，结果更加客观可靠。

材料和方法

1． 实验动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8周，中国药品生物制品检定所。
2． 标准品：rHuEPO国家标准品，批号：980528，中国药品生物制品检定所。
3． 试剂：乙二胺四乙酸二钾，国产。牛血清白蛋白，进口分装。
4． R-500网织红细胞分析仪测活法：
    小鼠分成6组：标准品3组，样品3组，每组至少四只小鼠。标准品和样品均按每只小鼠1.8、3.6、7.2IU三组注射剂量，分别连续三天皮下注射小鼠，于第四天内眦静脉采血，1%乙二胺四乙酸二钾溶液抗凝，用Sysmex R-500全自动网织红细胞计数仪计数出每只小鼠网织红细胞对红细胞总数的比值（RET%）。根据标准品和样品的各剂量组小鼠的RET%值，采用剂量反应平行线法，计算出样品的效价。

结果

1． 仪器测定的重要性：
    用R-500网织红细胞分析仪分别测定低、中、高剂量组的血样本，结果见表1。由表1可见，用全自动R-500网织红细胞分析仪，检测结果重复性好。

2． rHuEPO剂量--反应曲线：
    用R-500网织红细胞分析仪法测得的剂量--反应曲线和用显微镜计数网织红法的相一致[1]，结果见图1。

3． 准确性：
    用R-500网织红细胞分析仪法和显微镜计数网织红法[2]分别对20批rHuEPO制品进行测定,结果见表2.经统计学配对t检验  ，P>0.05，两法差异无显著意义。

讨论

    网织红细胞法测rHuEPO体内活性目前已是很成熟的方法，但显微镜计数网织红细胞法不仅实验操作繁杂、耗时耗力，而且避免不了人为计数误差。1999年版《欧洲药典》[3]测定rHuEPO体内活性是采用流氏细胞计数仪来测定网织红细胞数，且对血样要进行稀释染色等预处理。流氏细胞计数仪是细胞计数领域的经典仪器，但其价格昂贵。R-500仪是近年新近推出的用于测定网织红细胞的专用仪器，不需预处理血样，操作简便，临床上已广泛使用。但应用R-500仪来测试动物特别是小鼠的血样本篇还是首次报道。
    由于人与小鼠的网织红细胞大小不同，因而不能用R-500仪测人血的设置参数来测定小鼠血样；否则测定的低、中、高剂量组血样的RET%曲线是一条平线，无剂量反应关系。我们经过多次摸索，同时与显微镜计数结果比较，设置如下参数来测定小鼠血样：RBC-X=6.7ch，RET-X=27.5ch，RET-Y=167.5，DW/X=1.04，DW/Y=0.36，PLTE=1。
    由表2的结果可见，R-500分析仪法与显微镜测得的结果相一致，统计学t检验差异无显著意义，说明R-500分析仪法完全可以取代显微镜计数法，这将是网织红细胞测活法的一大飞跃。它的应用不仅缩短了实验周期，而且使实验结果更加准确可靠。
    另外，据我们经验，认为R-500分析仪最好做如下改进：根据每种动物血样需要不同的仪器参数，在主机电脑软件中设计不同的应用程序。在使用中，根据所用的动物调用相应的应用程序，使操作更简便快捷，同时也可满足不同实验室的多种实验需要。

摘自：希森美康网站