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蚌埠医学院附属医院检验科 李兴武　

    血清 AST测定作为心肌及肝脏疾病诊断的重要酶之一,已广泛应用于临床。而其线粒体同工酶(m-AST)的测定过去人们常用电泳法[1],但其敏感性、重复性差 ,不适合自动化,后来也有用 ELISA法[2]和离子交换树脂法 ,而免疫抑制法是国内近年推出的一种测定 m-AST的新方法。现就 m-AST测定的方法学做一评价 ,并对其在心肌疾病诊断过程中的应用作初步探讨。
1　材料与方法
1 . 1　原理　液体型免疫抑制法试剂盒由上海玉兰公司提供 ,测定原理反应式为:兔抗人多克隆s-AST-Ab+血清中s-AST-Ag s-AST-Ag-Ab(使 s-AST失去活性 )。
天门冬氨酸 +α-酮戊二酸 m-AST 草酰乙酸 +谷氨酸草酰乙酸+NADH+H+MDH 苹果酸+NAD+以 NADH在340 nm波长的吸光度(A)的减少计算 m-AST的活力。
1.2　仪器　Cobas Fara- 全自动离心式生化分析仪,由瑞士 Roche公司生产。
1.3　方法　采用免疫抑制法,参数如下 :波长为 340nm,温度37C,校准方式因子法,计算因子(F值)2646,样本15μl,稀释液(H2O)20μl,试剂 1:180μl,免疫抑制时间300s,试剂2:45μl,H2O10μl;测定模式:连续监测法,延迟时间为70s,读数时间为140s,读数点间隔10s,测定结果并自动打印。

2　结果
2 .1　 m-AST抗体试剂的线性范围　取活性值为292U/L的 m-AST标本 (稀释后测定),分别用pH为7. 4PBS缓冲液按1/6,2/6,3/6,4/6,5/6,原倍稀释,用本法测定 ,平行测双份取均值 ,测得 值为:47.9,97.8,145.6,195.5,249.9,305.1U/L,用样本稀释度-m-AST活性值做曲线 (见图1),可见当m-AST活性达到 200U/L时曲线即开始弯曲 ,说明此试剂的线性为200U/L。此时相关方程式为Y(原值)=0.996 7X(测值)+1.025。
2.2　试剂的精密度测试
2.2.1　批内重复性测试 :取正常混合血清及 m-AST活性较高的患者血清各 20份 ,批内每份测2次,结果按(x±s)U/L,CV表示为:低值7.7±0.5,6.5%;中值47.8±2.1,4.4%;高值 291.9±6.8,2.34%。
2.2.2　批间重复性试验:用上述标本作批间重复性试验,每天各测2次,共测15d,结果按(x±s)U/L,CV表示为:低值为7.8±0.7,9.0% ;中值46.8±3.2,6.84%;高值292.3±13.4,4.6%。

2.3　准确性试验
2.3.1　回收试验 :分别取混合血清一式二份,用本法测定后 ,分别于200μl混合血清中各加入定值血清10μl和本室测得高值标本10μl,测定后计算回收率 ,结果为98.2%～104.4%,平均为101.4%。
2.3.2　干扰试验 :取混合血清一份 ,测定原值后分成四组 ,每组又分成若干等份,第一组使之含血红蛋白浓度为0～10g/L,第二组使含胆红素 0～460μmol/L,第三组使含甘油三酯0～8mmol/L,第四组使含抗坏血酸0～8g/L,分别进行干扰试验 ,结果血红蛋白≤4g/L,胆红素≤340μmol/L,甘油三酯≤5.5mmol/L和抗坏血酸≤6g/L时对m-AST的活性无干扰作用,说明此法的抗干扰能力较强。
2.4　试剂的稳定性　将试剂置室温(25°C) ,按每30min测一次试剂空白吸光度 ,结果在10h之内吸光度无明显改变 ;将液体试剂放于4°C冰箱保存 ,分别在1,3,6,9,12m测定试剂吸光度,结果发现12m之内试剂空白吸光度基本不变 ,可见该试剂的稳定性能较好。
2.5　正常参考范围确定　选取正常体检者52例 ,男38例,女14例,年龄21～46y,平均32y;均无心、肝、肾等疾病或疾病史 ;按本法测定后并将数据进行统计学处理,结果(x±s)为 8.7±2.8U/L,范围为3.1～14.3U/L,基本呈正态分布 ;且男女之间无显著性差异。
2.6　在心肌疾病诊断中的临床应用　对11例病毒性心肌炎,6例心肌梗塞患者、8例心肌病、7例心脏换瓣直视手术体外循环患者的术后进行观察 ,结果见表1。
3　讨论　近年来 ,人们对 AST同工酶的测定逐渐重视起来 ,国外有文献报道其对肝胆疾病 [3]及急性心肌梗死[4,5]患者的诊断具有较高的临床价值。本文采用兔抗人多克隆 s-AST抗体与待测标本中 s-AST特异性结合形成免疫复合物,使 s-AST活力受到抑制后而测 m-AST活力。结果表明 :本法准确性高 ,重复性好,试剂较为稳定,反应线性可达200U/L,在对几种心肌疾病的检测中发现,其在心肌梗塞中增高幅度最大,升高程度与心肌损伤程度成比例 ,这说明当心肌细胞在受到损伤时,细胞膜的通透性增大 ,m-AST容易透入血液 ,因此 m-AST活力测定应列为心肌梗塞的最有价值酶学指标之一,也是诊断心肌损伤较敏感的指标。但令作者感兴趣的是 :在一些心肌疾病的早期 ,其总酶正常的情况下,m-AST或 m-AST/ s-AST是否发生变化,还有待于进一步探讨。
表 1　心脏疾病患者血清 m-AST的变化 (x�悺� s,U/ L)
组别        n   m-AST       AST
心肌病     11  1 1± 5      2 8± 1 8
心肌梗塞    6  1 2 4± 31   2 56± 74
心肌炎      8  46± 1 8     1 1 7± 39
心脏换瓣术  7  97± 2 9     2 1 3± 67
 与正常对照及心肌病比较 P<0 . 0 0 1。
　　由于本法打破了 m-AST测定的传统方法 ,提高了 m-AST检测的灵敏度及阳性率 ,使 m-AST的测定走向规范化和自动化。在指导临床对心肌疾病的诊断、鉴别诊断及预后判断上具有重要的临床意义。

摘自：《陕西医学检验 》2001年 第 16卷第4期