王忠芳 李金明 2002年底，在我国广东省出现了一些病因不明的非典型肺炎，伴有严重的可以危及生命的呼吸系统症状。随即在越南，加拿大和香港等地出现家庭成员或医护人员聚集感染的现象。非典型肺炎于2003年2月被命名为严重急性呼吸综合征（Severe acute respiratory syndrome，简称SARS）［1,2］。 2003年4月17日，WHO宣布经9个国家计有13个实验室参加的WHO SARS 研究项目组已发现，SARS病原体为一种人类从未发现过的，属冠状病毒科的新型病毒［1,2］。截止到2003年4月22日，累计共有27个国家和地区，先后3 947人患有SARS，其中死亡229人［3］。本文拟对病原体发现过程及现有的检测方法方面作一综述。 一、病原体的分离和鉴定 1排除已知的病原体：SARS病人的非特异症状可以由许多病原体引起，从而使最初对临床标本的检测只能从一个较大的范围入手，该病原体范围包括细菌、病毒、衣原体和立克次体。实验室检查集中在一些已知的导致呼吸系统疾病的病原体，尤其是那些能够导致小气管病变的病原体［1］。加拿大的一些实验室（下称第一研究小组）通过用电镜扫描技术和直接荧光抗体实验排除了流感病毒A和B，副流感病毒1、2、3型，腺病毒，呼吸道合胞病毒。该小组还用病人的尸检组织对下列病毒做了免疫组化实验，包括流感病毒A和B呼吸道合胞病毒，腺病毒，hendravirus, 圆病毒（circovirus），汉坦病毒，麻疹病毒，肠道病毒，黄病毒，欧洲沙粒病毒，地方性斑疹伤寒立克次体，柯克斯体属，鼠疫耶尔森菌，肺炎支原体和肺炎衣原体，所有的免疫组化实验结果都为阴性［1］。德国和法国的一些实验室（下称第二研究小组）应用针对相应病原体的特异的PCR检测肺炎支原体，肺炎衣原体，人类巨细胞病毒，腺病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1、2、3、4型，hendravirus, 圆病毒（circovirus） 人类超级肺炎病毒（human metapneumovirus，HMPV）, 流感病毒A和B，鼻病毒,人冠状病毒OC43和229E，并利用通用引物检测疱疹病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、肠道病毒、甲病毒、黄病毒、丝状病毒和副粘病毒，结果皆为阴性［4］。包括美国，香港和台湾在内的一些实验室（下称第三研究小组）对采集的呼吸道分泌物和血标本，进行分子生物学实验。通过提取DNA并经针对各种DNA病毒的各自特异的PCR反应检测，排除了许多DNA病毒，如腺病毒，细小病毒,圆病毒（circovirus）, 疱疹病毒, 正豆病毒,通过提取RNA并经针对各种RNA病毒的各自特异的RTPCR检测，排除了许多RNA病毒。诸如流感病毒A和B，副流感病毒1、3、4型，HMPV，丝状病毒（埃波拉病毒和马堡病毒）沙粒病毒属, 麻疹病毒, 流行性腮腺炎病毒,汉坦病毒,克里米亚刚果出血热病毒,对RNA病毒反转录酶保守序列的RTPCR以及对副粘病毒和布亚病毒的巢式PCR，所有都为阴性。部分病例的咽拭子和气管洗液，用一对引物扩增出了HPMV序列，但经过验证为污染［1］。 2病毒培养：包括鸡胚接种，细胞培养和乳鼠接种。第一研究小组从Vero细胞培养中分离出一种新的病毒，该病毒是用部分病例的呼吸道分泌物标本接种，细胞病变出现在接种后的第6天［1］。在用绿猴肾细胞(VeroE6)培养细胞时，发现用恢复期的SARS病人血清可以抑制病毒的增殖［5］。在与来自美国，加拿大和香港的数百份非SARS捐赠者的血清中，没有发现该病毒的血清学反应［5］。电子显微镜照片显示，从细胞培养和SARS病人的呼吸道分泌物中分离的病毒为冠状病毒样颗粒［5,6］。第三研究小组将血，血清，咽拭子或洗液和尸检的组织等临床标本，接种了许多细胞株系列，包括VeroE6，人肺粘液表皮样癌细胞(NCI292)，宫颈鳞癌细胞(Hela)，狗肾细胞株(MDCK)，人肺癌细胞株(HUT292)，印度恒猴肾细胞(LLCMK2)和EB病毒转化细胞系，以及乳鼠的腹腔接种和颅内接种。结果发现只有VeroE6，NCI292细胞通过从口咽部所取样本接种的VeroE6在接种5 d后出现空泡样变。SARS相关的人类冠状病毒从VeroE6细胞中分离出来并得以培养是不曾预料的，因为已知的人类冠状病毒对于培养的细胞株，组织培养或乳鼠的接种是极为挑剔的。在已知的人或动物的冠状病毒中，只有猪流行性腹泻病毒能够用VeroE6培养，但细胞病变与新发现病毒截然不同，为合胞病变［4］。 3确定为新型冠状病毒：第二研究小组从培养7 d的Vero细胞中分离的病毒，提取核酸经逆转录后，分别在宽松的反应条件下进行了15个不同的PCR反应。得到约20个DNA扩增片段并测序，Blast后发现其中三段不能与数据库中的任何序列匹配，但经翻译后的氨基酸序列与已知的冠状病毒序列同源，表明分离病毒为冠状病毒［4］。第三研究小组通过设计一对适用于所有的冠状病毒的通用引物扩增Vero细胞培养的与SARS有关的新病毒，这些病毒包括人类冠状病毒229E和OC43，犬冠状病毒，猫传染性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒，牛冠状病毒，猪脑脊髓炎病毒，涎泪腺病毒，鼠肝炎病毒，火鸡冠状病毒，鸟传染性支气管炎病毒。得到扩增片段后依此设计针对该病毒的特异性引物继续扩增培养病毒，得到含405个核苷酸的片段，测序并与数据库中的其他人类和动物的冠状病毒相比，该区核酸和相应氨基酸序列的相似性分别为056～063和057～074［3］。上述两个小组将所得的片段测序后经基因系统分析，皆与已知的人和动物的冠状病毒的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群不同，故认定为新型冠状病毒［3,4］。该病毒为单股正链线状RNA病毒，29 736个核苷酸。 现已知两个序列相差不多，表明病毒可能进行自然变异，从目前两个序列看不出任何重组的迹象。这种病毒有可能感染众多动物并且很快变异［7］。 4动物实验：2003年4月16日，荷兰ERASMUS大学实验室的科学家利用猴子感染病毒，并出现相应症状，成功完成了冠状病毒实验的动物模型。 综合以上4个方面满足了国际病毒学界确认病原的“Koch假说”(Koch′postulates)［8］。 二、目前所能做的检测及其意义 1抗体检测：SARS病人在临床症状出现约20d左右可以用ELISA检测到抗SARS抗体IgG或IgM。在部分病人出现症状14～21d时，可以在血清中测到抗体。用Vero细胞培养的SARS病毒可以在症状出现的第10天通过免疫荧光检测血清中的抗体（IgM），该实验结果可靠，但需要细胞培养和免疫荧光显微镜［3，9］。且在急性期或恢复期，测该病毒的ELISA或间接免疫荧光反应与两种已知的人类冠状病毒OC43和229E没有交叉反应［5］。 2分子生物学检测：在2003年3月27日，香港科学家已设计出PCR试剂盒［10］。2003年4月3日，WHO已公布了7对引物可以进行RTPCR［11］，虽然现存的PCR诊断实验能够确诊早期疑似病人。但德国生物技术公司（german biotechnology company）生产的PCR诊断试剂盒，已有漏检的报告出现。PCR诊断实验的阴性结果并不能说明没有SARS病毒［12］。 2003年4月17日，随着SARS病原体的确定及病毒序列的测定，WHO SARS 研究项目组已决定在今后工作中优先发展诊断实验。首先要建立一个包括不同国家，处于SARS病程不同阶段的送检标本的数据库，SARS病程不同阶段的标本将有助于确定何种阶段的SARS病人具有感染性，恢复期病人是否已不具备传染性。另外，还需要建立一个来自世界不同国家的SARS标本的基因库，以确定该种病毒是否具有不同的基因型。基因库的建立将对药物与疫苗的研制具有重要意义［12］。 3细胞培养：用SARS呼吸道分泌物和血标本接种Vero细胞进行验证［9］。 虽然病原学的检测已有所进展，但上述所列检测方法因缺乏大样本临床验证，检测条件或技术原因，尚未作为确诊依据。目前，临床判断依据如下：(1)流行病史：与发病者有密切接触史，或属受传染的群体发病者之一，或有明确传染他人的证据；发病前2周内曾到过或居住于报告有传染性非典型肺炎病人并出现继发感染病人的城市。(2)临床症状：起病急，以发热为首发症状，体温一般高于38℃，偶有畏寒；可伴有头痛、关节酸痛、肌肉酸痛、乏力、腹泻；常无上呼吸道卡他症状；可有咳嗽，多为干咳、少痰，偶有血丝痰；可有胸闷，严重者出现呼吸加速、气促，或明显呼吸窘迫。(3)实验室检查：早期发热期白细胞数目不升高或降低，常有淋巴细胞计数减少。(4)胸部X线检查：有不同程度的斑片状浸润性阴影或呈网状改变。(5)抗生素治疗无效。 以上所有实验都须在P3实验室内操作，生物危险级别为3。 上述3个研究小组都属于WHO SARS 研究项目组。该项目组是一个包括中国大陆（1个），中国香港（3个），新加坡（1个），中国台湾（1个），日本（1个），美国（1个）英国（1个）法国（1个）德国（1个）加拿大（1个）荷兰（1个）等9个国家计13个实验室参加的网络实验室。 摘自：《中华医学杂志》
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