北京大学第一医院检验科   靳彩宁，徐国宾，朱立华，夏铁安

关键词：肌钙蛋白I；心肌损伤；生物学特性；诊断方法

   肌钙蛋白I（troponin I,TnI）和TnC、TnT组成复合物，在肌肉收缩和舒张过程中起重要调节作用。大量临床研究证实，心肌TnI(cTnI)为心肌损伤最特异、最敏感的血清标志物之一，被广泛应用于临床诊断。本文就cTnI的生物学特性和临床应用进展作一概述。

1  人cTnI的生物学特性

1．1  cTnI的基因结构与定位  cTnI由基因TNN13编码，TNN13基因全长6.2kb，由8个外显子构成，位于19q13.4。1990年，Vallins等克隆人心肌cTnI的全长cDNA。TNNI3为TnI基因家族和一种同种型（isoform），为由肌型，另外两种为骨骼肌型，它们分别编码慢反应sscTnI（由TNNI编码）和快反应fscTnI(由TNNI2编码)。TNNI1和TNNI2基因在骨骼肌细胞中的特异表达，需要上游的启动子元件和位于内含子区的增强子等，而在心肌肌细胞内，包括98bp启动子序列就能驱动TNNI3基因的表达，此基因前三个内含子中未发现有增强子的活性。Barton等人发现，编码TnI和TnT亚型（cTnI，fTnI，sTnI）的六个基因位于三条染色体上，每一条染色体上都有一对TnI-TnI基因。TNNI和cTnI的基因位于1号染色体上，两基因之间的插入序列长度大于20kb；TNNI2和fTnI基因位于11p15.5，二者紧密连锁，两基因之间插入了长度约为100~300kb的序列；TNNI3和sTnI基因在19号染色体上，两基因之间有一段2.6kb的插入序列。在这三对基因中，TnI基因都位于TnT基因的上游。TNNI3基因异常可以导致肥厚性心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）。HCM是幼年瘁死常见的病因，是一种常见染色体显性遗传病，临床症状为心室增生并伴有肌纤维的紊乱。目前发现，至HCM的cTnI基因突变有六种，它们分别是五种错义突变：R145G，R145Q，R162W，G203S，K206Q和一种缺失突变del183K。

1．2  cTnI蛋白质的结构及其抗原性 cTnI为一具有209个氨基酸的多肽，相对分子量为24 000，预测的pI约为10。CTnI与ssTnI和fsTnI有40%的同源体，主要区别在1、2、3位外显子。CTnI的1、2、3位外显子较长，可编码N端的47个氨基酸，而sTnI1、2、3外显子短，只能编码N端21个氨基酸，较cTnI短26个氨基酸，5、6、7外显子在cTnI和sTnI具有高度的同源性。CTnIN未端26个氨基酸中的两个丝氨酸可以通过cAMP依赖的蛋白激酶的磷酸化作用，调节cTnI的功能。CTnI蛋白质以两种形式存在于心肌细胞内，即小部分游离于胞质中，为可溶性，大部分以结构蛋白形式固定于肌原纤维上，为不溶性。当胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流；而结合的cTnI则逐渐分解出来，成为游离的cTnI。所以，急性心肌梗死时，cTnI可较早地在血中出现，并持续较长的时间。在cTnI蛋白质的功能域中，抑制区是其最重要的功能区。它能在无钙离子存在的情况下，与组成细纤丝的肌动蛋白相互作用，抑制肌球蛋白的ATPase活性。抑制区的序列最短可仅包含残基137~148。CTnI的C端残基187~198也影响肌动蛋白的结合和其抑制作用的发挥。
      Ferrieres等人利用68条重叠的能覆盖cTnI全长序列的合成肽进行抗原表位作图来研究cTnI抗原性的特点，结果发现，实验中所用的所有16株鼠抗人cTnI单抗至少能识别其中一个肽的表位，这表明这16株抗cTnI的单克隆抗体对cTnI的识别不依赖于蛋白质的三级结构。据这些肽与兔或鼠抗人cTnI多克隆抗体的反应活性可知，cTnI蛋白质大部分序列均具有抗原性，其中N末端和C末端的抗原性最强。利用计算机程序对cTnI蛋白质二级结构进行预测的结果显示，cTnI是一种富含a螺旋的蛋白质。结合抗原表位实验结果，可以推测cTnI不是球蛋白，其蛋白质肽链可能采取一种更为伸展的构想，这种结构的蛋白质分子，其大部分序列都具有抗原性。

1．3  cTnI表达的心肌特异性  人cTnI基因是在心肌特异表达的。Bodor等运用cTnI特异的单抗，对不同来源的人肌肉组织冰冻切片行免疫组化染色，同时用免疫荧光法测定组织匀浆中的cTnI水平。实验结果表明，正常胎儿和成人的骨骼肌组织，及所有的多肌炎和肥大性进行性肌营养不良（DMD）患者的组织中都没有cTnI心肌表达。Ricchiuti等的研究进一步证实了cTnI心肌的表达的特异性。他们从4例健康人心肌、5例健康人骨骼肌、7例终末期肾病患者骨骼肌和5例DMD病人骨骼肌的标本中提取RNA，分别针对cTnT 、sTnT、 cTnI序列的特异引物，进行逆转录PCR扩增。同时，分别用cTnT 、sTnT、 cTnI的单抗，对蛋白样品进行westerm blot分析。结果发现，在所有的心肌标本中、4例终末期肾病患者骨骼肌中、2例DMD患者骨骼肌中检测到cTnT的PCR扩增产物，蛋白质印迹试验也是阳性。在健康人骨骼肌中均没有发现cTnT mRNA的表达；在所有的心肌标本中，均检测到cTnI特异的mRNA扩增产物；在健康人或病人骨骼肌标本中没能检测出cTnT mRNA的表达。

2  血清cTnI 测定的方法学

    cTnI 的测定始于20世纪80年代中期，多采用双抗体竞争放免法和竞争性ELISA测定法。由于实验中所用的抗体都多为克隆抗体，因而交叉反应多，灵敏度差，测定低限只能达到4µg/L。单克隆双抗体夹心放免法和双抗体夹心ELISA法使测定的灵敏度大大提高，测定低限为0.1~0.2µg/L。目前，cTnI的检测多采用化学发光法。其中Hossein-Nia所报道的化学发光免疫测定法，将2株单抗共价偶联于顺磁珠（paramagnetic particles）上作为固相，利用亲和纯化的对cTnI的N末端区特异的多抗，用化学发光物质标记后作为检测抗体，大大提高了测定的精确性和敏感性，此法测定的低限为0.15µg/L。
    据报道，对同一病人的血标本，用目前市售的几种不同的化学发光免疫测定试剂盒测定血清中的cTnI水平，各测定结果之间可差10~20倍。这引起了众极大的关注。分析原因，可能由以下几个方面引起：
    ①不同测定方法运用不同校正品；
    ②取样要求的不同，如血清、血浆或全血及使用不同的抗凝剂；
    ③不同搞体识别不同抗菌素原表位的能力不同，或cTnI与TnC 或/和TnT形成复合物时构象的不同；
    ④包含不同表位的cTnI蛋白酶角片段，由于不同的清除率或降角程度的不同，在血清中的半衰期不同；
   ⑤不同的检测系统本身的假阳性；
    ⑥一些突变位点的存在可能影响cTnI某个抗原表位；
    ⑦血循环中cTnI被氧化、还原、磷酸化等。目前较为一致的观点普遍认为，造成各方法测定结果差异的原因是由于使用不同的校正品所致。Shi Qinwei等运用StratusⅡ(Dade International),Opus(Behring Diagnostics)和ACCESS（Beckman Instrument）系统分别测定Stratus质控品、ACCESS质控品和Opus质控品。结果表明，除了Stratus质控品用ACCESS和Opus系统测不出值以外，另外两个质控品用不同系统所测值之间的最大变异不超过5倍。这也表明，不同校正品的使用最多造成了不同系统之间的20%的变异。因此，可能存在有其他影响cTnI的方法都为夹心免疫测定法，因而需要抗体识别的靶表位完全暴露并有正确的构象，且两靶表位之间的区域不被水解。而运用不同抗体进行测定的不同方法，就需要不被水解的cTnI的区域不同。所以cTnI各区域不同的降解情况，也就可能导致了各测定方法之间的变异。Shi Qinwer 等用分别表达有4个cTnI片段的E.coli细菌裂解液，来测试它们与StratusⅡ，Opus和ACCESS免疫试剂盒之间的反应性。并用不表达任何重组蛋白的E.coli细菌裂解液作为阴性对照，用纯化的全长cTnI作为阳性对照。结果表明，Stratus和Opus抗体识别cTnI的N末端部分，而ACCESS的抗体识别cTnI的C末端部分。应用对cTnI的N末端部分和C末端部分特异的单抗，对加有重组cTnI的正常人血清和加有重组cTnI复合物的正常人血清，在37℃分别孵育2、4、6、24和48h后，行westerm blot分析的结果表明，cTnI的C末端部分更易被降解。这也可能是造成这三种测定方法之间变异的主要原因之一。
    鉴于各种可能影响cTnI测定因素的存在，就给判断cTnI参考范围和变异系数，分析测定的干扰因素，决定诊断的窗口期及诊断和预后的界值等带来困难。解决cTnI测定的标准化问题，已是众望所归。Katrukha等用不同的免疫学方法分析在人坏死组织的血清中cTnI被蛋白酶降解的情况时，发现位于氨基酸残基30~110之间的片断高度稳定，不被降解，这可能是由于其与cTnC形成复合物之故。因为游离cTnI在血循环中的半衰期只有5 min，他们认为，血清中的cTnI主要以复合物的形式存在。Giuliani等利用ELISA夹心法，分别测定了血清中cTnI、cTnI-cTnC和cTnI-cTnC-cTnT的复合物。结果发现，血清中cTnI的主要形成二聚体复合物cTnI-cTnC。根据cTnI的C末端易被降解，及其易形成复合物的特点，有理由认为，血清中的cTnI，是以其C末端被降解的形式，稳定存在于肌钙蛋白复合物中。这也就为解决cTnI测定的标准化问题提供了思路。Shi Qinwei等认为，若某一标准品为cTnI所有抗原表位等摩尔浓度的混合物，并且测定中所有抗体，能够识别血清中最稳定cTnI片段上的抗原表位的话，会有助于cTnI测定的标准化。鉴于cTnI复合物在有螯合剂存在的情况下易解离的特性，最新研究表明，通过基因工程方法得到的两种cTnI-cTnC单链多肽：ScTnI-C和ScTnI-C-2(ScTnI-C由全长的人cTnI和cTnC组成，ScTnI-C-2由人cTnI28~110片段和全长cTnC组成)，经单抗亲和层析纯化后，均可作为标准品使用。

3  cTnI 测定的临床意义

3．1   诊断急性心肌梗死（AMI）WHO推荐患者有胸痛、心电图改变、心肌酶学异常三项指标中两荐符合，即可诊断为AMI。其典型病例易确诊，而不典型病易被漏诊。25%的AMI患者心电图无异常改变，故对这部分病人血清学检查显得尤为重要。常用AMI的血清指标有：cTnI、肌红蛋白（Mb）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、骨酸激酶（CK）、心肌肌钙蛋白T（cTnI）等。这几项指示在AMI时的血清学行为如表1所示。
表1   诊断AMI有关指标的血清学行为 

	cTnI	Mb	CK-MB	CK	cTnT
AMI胸痛发作后血中出现的时间（h）
	3.3-6.0	2.5-4.5	3.3-4.9	3.3-6
达峰时间（h）	11.5-24.0	6.0-10.0	10.0-20.0	14.2-27.0
胸痛 敏感性 4h  特异性 ROC效率	0.769	1.00	0.923	0.69	0.818
	1.00	0.4	0.78	0.66	0.907
	0.956	0.56	0.81	0.67
胸痛 敏感性 70h 特异性 ROC效率	1.00	0.20	0.37	0.62
	1.00
	1.00
对诊断AMI 最大灵敏度（h）	10-70.0	2-8	7-24

    由此可见,cTnI在特展品及ROC效率上具有独特的优势,而在AMI发生初期,其敏感性较差,但其诊断的窗口期最长,可达7-9天.另外,作为诊断AMI“金标准”的CK-MB，由于采用催化省活力单位，易受同工酶（CK-BB，CK-MM）等亚单位的干扰，使结果偏高产生假阳性，如采用质量浓度单位，CK-MB的特异性问题仍无法解决。因而，对颖似AMI患者，早期血清指标要做：Mb、CK-MB两项，MB仅为过筛试验，CK-MB（-）、cTnI（+）者你认为是高危患难者，CK-MB（-）、cTnI（-），临床症状可疑者，需做3，6，9，12h cTnI动态观察。以减少AMI的漏诊，因为cTnI在胸痛10h对AMI诊断的特异性、敏感性、ROC效率均为1.00。

3．2   监测AMI病人的溶栓后再灌注情况，胸痛缓解，ST段改变恢复正常以及再灌心律失常是冠脉再通的指标，然而这三项指标仅表现于15%的患者。基于外周血CK、CK-MB酶活性变化曲线，对于再灌注的效果只可作精略的回顾性评价。成功监测接受深栓治疗患者的再灌注，可以使一部分溶栓失败的病人受益于进一步的介入治疗。Apple等对25例AMI患者溶栓前后cTnI、CK-MB及Mb的变化进行了观察，并与冠状动脉造影结果相对归，发现冠状动脉再通者cTnI、CK-MB及Mb值于溶栓90min后均显升高，而冠脉依旧栓塞者以指标升高不明显。并且发现如果以溶栓后90min与溶栓前cTnI差值为指标，可于溶栓90min内较好地反映再通情况，敏感性优于CK-MB及Mb。

3．3    对伴有创伤横纹肌溶解、心肌损伤患者的诊断。
Alain等检测了15例入院24h的早期创伤后横纹肌溶解、心肌损伤患者的血清的cTnI和cTnT。有4例患者入院时未测出cTnI，其cTnT值较低，其余患者入院时即测出cTnI。24h后对这15例病人再次进行检测，发现13例横纹肌溶解、心肌损伤患者（24份标本）cTnI和cTnT间密切相关（r=0.83）。其中8例患者cTnI和cTnT均低于其相应的参考值的上限。2例患者cTnI和cTnT低于参考值的上限，但cTnT高于参考值的上限，这2例患者肌酐均大于250umol/L，提示cTnT的升高可能是未预料的肾功能衰竭所致。该研究证实cTnI和第二代cTnT（试剂）在横纹肌创伤后早期患者有相似的变化。

3．4   对病毒性心肌炎（VMC）的诊断   心肌酶学检查作为心肌损伤的指标，在病毒性心肌炎的诊断中占重要地位。既往常规应用心肌酶谱检查作为心肌损伤的指标，但其敏感性和特异性较差。刘智勇等人探讨了cTnI对病毒性心肌炎价值，结果发现，cTnI、CK-MB、CK、AST、LDH的阴性率（%）分别为69.4,18.1,22.2,19.4和16.7。cTnI与CK-MB、CA、AST的敏感性比较都具有统计学意义（P<0.001）.且cTnI仅在心肌特异表达,而CK-MB、AST、LDH非心肌细胞所特有，可产生假阳性。因而cTnI作为心肌细胞受损的敏感而特异的指标，在心肌炎早期诊断中具有很好的应用前景。

4  小结

    cTnI测量是目前诊断心肌损伤的一项很有前景的生化标志物。具有特异性好，灵敏度高
的优点。但由于它在血清中不稳定，极易被降解，及易形成复合物等特点，使人们对解决cTnI测定的标准化问题一筹莫展。如何制备得到针对cTnI稳定区特异的、亲和力高的单克隆抗体，及可溯源和稳定的标准品，成为人们关注的焦点。许多人已在这方面作了尝试，结果还有待评价。

摘自：《临床检验杂志》2002年第20卷第2期