武建国（南京军区南京总医院，全军医学检验中心，南京210002）

    2002年11月16日，广东佛山发现首例传染性非典型肺炎患者，此后疫情迅速向全球播放。2月28日，WHO的CarloUrbani博士建议将此病命名为严重为急性呼吸综合症（servere acute respiratory syndrome,SARS）。3月12日、15日、27日，WHO三次向全球发出SARS警告，并提出SARS概念及定义。经过10个国家和地区13个实验室的通力合作，在满足科赫（Robert Koch,1843-1910,德国细菌学家）条件（Koch’postulate）之后，4月16日WHO正式宣布；SARS的病原是一种新型冠状病毒（SARS coronavirus）。至2003年6月5日全球有8403人罹患SARS，775人死亡。60岁以上死亡率为43.3%（35.2%～52.4%）老龄、中性粒细胞升高、严重的淋巴细胞减少、ALT和LD活性升高为危险因素。
与很多已知烈性传染病相比，SARS并非特别“强大”，初期在我国猖厥，除对本病认识不足、应对上存在薄弱环节外，一个重要原因是SARS缺乏早期诊断的实验室检查方法。本文对现有工作作一简要回顾，并对存在问题与应对措施提出管见。

1 现有方法及其局限性

1.1   特异性的实验室检查方法

    1.1.1  病原分离   将患者口咽、鼻咽部分泌物接种Vero E6细胞（猴贤源），第5天左右出现细胞病变，用电镜（负染或超薄切片）检查可在胞质中找到冠状病毒颗粒；与恢复期SARS患者血清反应，再加荧光素标记的抗人IgG，感染的Vero E6细胞可出现典型的细胞质与膜的荧光图像。此法耗时长，需特殊设备，不适于常规开展。

    1.1.2   测定特异性抗体
    1.1.2.1    间接免疫荧光试验   用感染SARS病毒的Vero E6细胞冷丙酮固定后作抗原片，依次与1∶10稀释待测血清和FTTC—抗人IgM或FTTC—抗人IgC反应，阳性时可出现典型荧光图象。此法需优质荧光显微镜，测IgM抗体时最好吸附除去待测血清中IgC。对广州和北京6家医院113例SARS患者血清测定，有99例（87.6%）测出抗体。病程≥11 d者IgM抗体阳性率65.6%，IgG抗体阳性率91.1%（国家SARS防治紧急科技行动北京组）。
    1.1.2.2  ELIS法   间接法试剂盒为北京华大吉比爱公司生产，以SARS病毒全病毒裂解物为包被抗原，一步法，用酶标记抗人IgM、抗人IgG为二抗，分别测定待测血清中抗SARS病毒IgM或IgG抗体，双抗原夹心法试剂盒由军事医学科学院生物工程技术研究所研制，测IgG、IgM混合抗体（可能还有IgA）。据解放军第309医院梁艳等报告，20名SARS患者用间接法检测，发病第1周IgM、IgG抗体均为阴性，夹心法有6例阳性（30%）；病后2周两法总阳性率分别为53.3%和73.3%，病后4周分别为84.8%和100%。IgM抗体最大高检出率在2~3周，达53%~60%。和免疫荧光试验一样，ELISA法测抗体也难于早期诊断。
    1.1.2.3  胶体金一步法SARS病毒抗体定性试剂  此试条由中国疾病预防控制中心等单位研制，以SARS病毒基因工程重组抗原包被试条，利用胶体金层析技术制成。据谓只需指血1滴5分钟可出结果，尚在临床评估中。鉴不此法也是测抗体，且金标层析法敏感性一般逊于ELISA法，估计在早期诊断方面也不会有所突破。

    1.1.3  RT-PCR测定病毒核酸   已有美、德、加拿大等国的实验室建立此法，有关引物序列已在WHO官方网站上公布。本法可测呼吸道分不泌物、漱口液、血、 尿、粪标本中SARS病毒核酸。广州市资料SARS患者漱口液检出率为73.2%；香港资料发病10天时粪、鼻咽分泌物、尿的检出率分别为100%、95%、50%，发病21天为66.7%、44.7%、21.1%。WHO认为，鼻咽分泌物为最适用标本，多部位标本联合检测可提高阳性率。但国内外资料也一致认为，本法假阴性率和
假阳性率都较高的问题还有待解决。

1.2   其他实验室检查

    1.2.1    血细胞与T细胞亚群   SARS患者白细胞数正常者占58.5%，<4.0×109/L者占34.0%，仅7.5%的患者>10.0×109/L；血小板数一般正常，<100×109/L者不足4%；绝大多数（81%）患者淋巴细胞数<1000/µl，T细胞数降低者占91.1%，CD4+T细胞减少者占98.1%,CD8+T细胞减少者占80.0%。根据国家SARS防治紧急科技行动北京组资料，病后10~12天病情最严重时，T细胞亚群计数也达最低值，第16天起随病情好转逐渐回升。CD4+细胞以<200×106/L为临界值，SARS患者降低率为43.6%（54/124）。CD4+/CD8+比值为1.51±0.69，与健康对照组（1.73±0.65）无显著差异（中国医学论坛报，203年6月5日2版）。

    1.2.2  血清酶学检查    SARS患者（急性期至恢复期）ALT、AST、LD、α-羟丁酸脱氢梅（α-HBDH)、CK、ALP、γ-GT活性升高的患者分别为35.9%、48.1%、12.1%、9.9%、14.3%、10.6%和9.8%（广东省中医院庄俊华等）。这除与患者的基础疾病有关外，与心、肝、肾、脾等重要脏器也受病毒感染波及有关。在心肌细胞、肺泡上皮细胞、毛细管内皮细胞、肾小管上皮细胞、淋巴结和脾内的淋巴细胞均可找到SARS病毒颗粒。因此，在一个没有其他相关疾病的人罹患SARS后，血清酶学的改变提示疾病的严重性。

    1.2.3  其他呼吸道病原检查   潘浩等用西班牙（Vircell-SL）公司生产的可测嗜肺军团菌I型、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1、2、3等9种常见呼吸道病原IgM抗体的荧光抗体试剂盒检测SARS疑似病例。此法可排除部份疑似病例，但阳性结果并不能排除这些病原与SARS病毒的混合感染。此外，在SARS病原明确之前也曾被高度怀疑的人类偏肺病毒（metapneumovirus）也可引起下呼道感染，应予排除（朱汝南，钱渊。中国医学论坛报，2003年4月10日）。

2   对策建议

    从上述简要回顾可知，目前SARS实验诊断的最大问题是不能在发病当日或3-4日内做出肯定或否定的诊断，这甚至可以说是制约SARS防治的一个瓶颈。像所有其他传染病一样，SARS在大的暴发流行后也不会终止。人类与SARS的斗争将是长期的。当务之急是应尽快建立完整可靠的、能早期诊断的实验室诊断体系，以迎接SARS新的挑战。

2.1 研制和建立快速检测SARS病毒抗原的试剂与方法   SARS病毒有6种主要蛋白质，即突起蛋白（spike glycoprotein,S蛋白），小包膜蛋白（small envelope glycoprotein,E蛋白），膜蛋白（nembrane glycoprotein,M蛋白），核衣壳磷蛋白（nucleocapsid  phosphoprotein,N蛋白），RNA聚合梅、3CL蛋白水解梅（3CLpro）。S蛋白直接与宿主细胞受体（可能是CD13，一种分子量15000~170000的糖蛋白，本质为氨肽酶aminopeptidase）结合，介导病毒包膜与宿主细胞膜融合、病毒脱膜并侵入细胞。M蛋白是在病毒复制装配时，将核衣壳与囊膜连接。S蛋白和M蛋白均可诱导机体产生中抗体。E蛋白在SARS病毒自我组装过程中起关键作用。N蛋白含有核转移信号序列，通过该序列进入细胞中与宿主细胞DNA整合。3CLpro是病毒复制酶合蛋白的组成部份，与SARS病毒复制密切相关，是抗SARS病毒药物筛选的理想靶点。目前这6种蛋白质的基因已成功克隆，相关蛋白正在或已经表达和纯化。应尽快探索用全病毒抗原或纯化的特异性病毒蛋白质（与其他呼吸道病原以及人类普通冠状病毒229E、OC43无抗原性上的交叉反应）制备高效价、高亲和力的多克隆或单克隆抗体，标记梅、荧光素或胶体金，建立检测SARS病毒特异抗原的ELISA，蛋白质芯片以及床边快速试验（金标记免疫层析或免疫渗滤），检测血、尿、粪例滤液、鼻咽部分泼物、支气管肺泡灌洗液等标本中的病毒抗原，或用直接荧光抗体试验检测鼻咽部分泌物、尿液中脱落细胞或外周血单个核细胞中的病毒抗原。

2.2 建立能判断病情和预后的辅助诊断试验   除已建立的T细胞亚群、血清梅学检查等之外，应科学地、前瞻性地设计、用定量PCR技术动态观察SARS病毒滴度与疾病严重程度之间的相关性。鉴于SARS发病过程中过量产生的自由基类分子阳导致肺部病变的关键性致损伤因子，因此，应建立对氧自由基（O2—）、一氧化氨自由基（NO），过氧亚硝基阴离子（ONOO—）等的测定方法，从疾病早斯开始进行系统的测定。有人认为，SARS肺部的病变，可能与患者产生的抗肺组织自身抗体有关，也应建立敏感性和特异性都能达到要求的检测方法，对不同病期的患者连续地进行测定。解放军等302医院王海宾等发现，隔日1次进行红细胞免疫粘附功能和淋巴细胞应激能力检查，连续3次有进行性改变者均确诊为SARS，而非SARS病例均无异常改变，故有望将SARS疑似病例的隔离观察期缩短至1周（中国医学论坛报2003年6月19日第2版）。当然，所有上述检测方法建立后，必须进行严格的考核，只有高精密度（可重复性）、高准确性、高敏感性和特异性的方法，才能用于临床实践。

摘自《临床检验杂志》2003年第5期