鄢盛恺

    众多流行病学与临床研究证实，动脉粥样硬化（AS）、冠心病（CHD）的发生率与血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平呈负相关，而与低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平呈正相关。美国国家胆固醇教育计划（NCEP）成人治疗专家组（ATP）新近发表的第3版文件（ATPⅢ，2001年）修改了血脂、脂蛋白水平异常的分类，低HDL-C [<1.03mmol/L(40mg/dl)]是CHD的主要危险因素，而高HDL-C[1.55mmol/L (60mg/dl)]被认为是负危险因子，具有保护性。将LDL-C新划分成5个水平，仍以LDL-C水平降低作为CHD防治的首要目标[1]。近年来国内外相继研制开发出一些新型HDL-C、LDL-C的直接测定方法即匀相测定法（homogeneous methods）试剂，因其简便、快速，易于自动化，已引起关注并广泛应用于临床常规分析[2~5]。
    1  HDL-C检测方法
    1.1  概述  测定血清HDL-C通常需根据各种脂蛋白的密度、颗粒大小、电荷等应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将HDL与其他脂蛋白分离开，测定HDL组分中胆固醇含量。美国疾病控制与预防中心（CDC）测定HDL-C的参考方法为超速离心法，也为NCEP所推荐。此法主要用于靶值的确定及各种HDL-C检测方法学评价，但因需特殊仪器，对技术操作要求高，一般实验室难以开展。CDC胆固醇参考方法实验室网络（CRMLN）近来选用了一种“指定性比较方法”（DCM法）作为转移CDC参考方法准确性的适用方法—硫酸葡聚糖-镁（DS50-Mg2+）沉淀结合ALBK法。这种方法相对CDC参考方法而言，已大为简化[6]。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究。
    国外把临床常规实验室直接分离测定HDL-C的方法分为3代[4]。第1代为化学沉淀法，常用的沉淀剂为多阴离子，如磷钨酸（PTA）、DS、肝素（Hep）或非离子多聚体如聚乙二醇(PEG)与某些两价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）合用。最早为美国国立卫生研究院（NIH）所采用的肝素-锰沉淀法（HM法），后多采用DS50-Mg2+法，欧洲则多采用磷钨酸镁沉淀法（PTA-Mg2+法）和聚乙二醇沉淀法（PEG法）[2,6]。但此类方法受apoB的脂蛋白组份沉淀不完全的影响。第2代采用简便的磁珠DS-Mg2+分离法（美国Reference Diagnostics和Polymedco 公司试剂），省去了离心步骤，但需特殊装置，试剂不适于推广应用[7]。第3代为匀相测定法[2,4]，标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面基本达到NCEP 的分析目标，因此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。与之相比较，国内的第1代为电泳法；第2代为化学沉淀法，1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2+法作为HDL-C测定常规方法[8]；第3代为目前广泛使用的匀相测定法。
    1.2  匀相测定法
    1.2.1 选择性抑制法（polyanion polymer/ detergent HDL-C assay，PPD法）[2,4,9~10]   亦称选择性遮蔽法。其应用两种不同的表面活性剂及多聚阴离子，根据脂蛋白的酶反应选择性，直接测定HDL-C。试剂Ⅰ中含多聚阴离子和分散型表面活性剂（亦称反应抑制剂），CM、VLDL、LDL在多聚阴离子环境下发生凝聚；由于反应抑制剂与CM、VLDL、LDL的疏水性基团具有高度亲和力，故其吸附在凝聚的脂蛋白颗粒表面形成遮蔽圈，抑制其表面的游离胆固醇反应。同时在游离的HDL表面也吸附有少量反应抑制剂，但由于亲和力较弱，其结合是可逆的。试剂Ⅱ中有对HDL颗粒中亲水性基团具高亲和力的可溶性表面活性剂（亦称反应促进剂）,其对HDL表面的吸附不仅置换出第一反应中HDL表面吸附的反应抑制剂，而且使HDL形成可溶性复合体，从而使HDL-C可直接与酶试剂[含胆固醇酯酶（CHER）、胆固醇氧化酶（CHOD）等]发生反应。该方法的主要代表试剂盒为日本第一化学（Daiichi pure chemicals Co.）Cholestest HDL和美国Genzyme Diagnostics公司的N-genousTMHDL-C试剂盒。
    1.2.2  PEG修饰酶法（PEG-modified enzyme HDL-C assay，PEGME法）[2,4,11]   在Mg2+的存在下，α-环糊精硫酸盐与CM、VLDL、LDL形成可溶性复合物。这些复合物能抵抗变构酶的作用；PEG6000或葡聚糖右旋糖苷与CHER和CHOD共价结合，引起酶的变构，变构酶对脂蛋白的大小和/或电荷具有选择性，其顺序依次为LDLVLDLCMHDL。而-环糊精硫酸盐能限制CM、VLDL颗粒进入环状的环糊状结构，从而避免酶的催化作用，这种作用还与Mg2+浓度有关。因此在Mg2+及少量DS 存在的前提下，可直接测定HDL-C。主要代表性试剂盒有日本协和（Kyowa Medex Co.）、罗氏诊断（Roche Diagnostics）和德国Centronic GmbH公司的产品。
    1.2.3  清除法（clearance method）
    1.2.3.1  反应促进剂-过氧化物酶清除法（synthetic polymer/detergent HDL-C assay , SPD法）[4,12,13]
     其原理为利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异。加入试剂Ⅰ，在反应促进剂（合成的多聚物/表面活性剂）的作用下，血清中CM、VLDL及LDL形成可溶性复合物，它们表层的游离胆固醇在CHOD的催化下发生反应生成H2O2，在过氧化物酶（POD）的作用下，H2O2被清除。加入试剂Ⅱ，在一种特殊的选择性表面活性剂作用下，只有HDL颗粒成为可溶，所释放的胆固醇与CHER和CHOD反应，生成H2O2，并作用于4-AAP色原体产生颜色反应。代表试剂盒是日本第一化学新近推出的Cholestest N HDL试剂盒。
    1.2.3.2  过氧化氢酶清除法（catalase HDL-C assay，CAT法）[4,14,15]   其原理为试剂Ⅰ中具有特异选择性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中CM、VLDL及LDL, 使其所含的胆固醇暴露，在CHER和CHOD的催化反应下生成H2O2，H2O2被过氧化氢酶（catalase）分解为H2O和O2 而被清除。试剂Ⅱ中的叠氮钠抑制了过氧化氢酶活性，另一表面活性剂使HDL颗粒中的胆固醇暴露，并与胆固醇酶试剂发生反应，用标准的Trinder反应即可测定HDL-C。应用两点速率法可减少高胆红素和高TG对测定结果的影响。代表试剂盒是日本生研（Denka Seiken Co.）和英国朗道（Randox Laboratories Limited）公司试剂盒。
    1.2.4  免疫分离法（immunoseparation method, IS法）
    1.2.4.1  PEG/抗体包裹法（International Reagents Corp HDL-C assay，IRC法）[2,4,16,17]   为最早期由日本国际试药公司（International Reagents Co.）研制的试剂盒（测定过程包括4种试剂）。原理是先用低浓度的PEG4000包裹CM、VLDL、LDL，加入特异性抗apoB、apoCIII抗体，使CM、VLDL和LDL颗粒复合物凝聚，然后加入胆固醇酶试剂，用于检测上述复合物以外脂蛋白胆固醇（即HDL-C），最后加入盐酸胍试剂，终止酶促反应和溶解含apoB脂蛋白复合物，以免其干扰吸光度测定。
    1.2.4.2  抗体免疫分离法（antibody immunoseparation HDL-C assay ，AB法）[4,18]  由日本和光制药公司(Wako Pure Chemicals Industry)新推出的试剂。其原理与上述方法相似。试剂Ⅰ中的抗人β脂蛋白抗体首先与血清中的CM、VLDL、LDL结合形成不溶性抗原-抗体复合物；加入试剂Ⅱ后，抗原-抗体复合物不与酶试剂起反应，只有HDL-C与酶试剂反应，生成H2O2，并通过Trinder指示反应测定HDL-C含量。

    2.LDL-C的测定方法
    2.1  概述   测定血清LDL-C通常需根据各种脂蛋白密度、颗粒大小、电荷或apoB含量等，应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开，然后测定LDL组分中胆固醇含量。目前尚没有真正意义的测定LDL-C的参考方法。CDC测定LDL-C暂定的参考方法为超速离心法（-定量法/BQ法），也为NCEP所推荐。此法测定的LDL-C，实际上包括脂蛋白(a)[Lp(a)]和中间密度脂蛋白(IDL)的胆固醇含量，也是评价其他检测方法准确性的基础。此法需昂贵的设备、操作复杂、费时且技术要求高，不易在普通实验室开展。Friedewald公式计算法是目前应用较广的估测LDL-C的方法，被NCEP推荐为常规测定方法[19]。其以VLDL组成恒定(VLDL-C/TG =0.2，均以mg/dl计）的假设为前提，具有简便、直接、快速等优点。应用此公式计算LDL-C常受TC、TG和HDL-C变异的影响，总变异可达9.5%。但在血清中存在CM、血清TG 4.52mmol/L (400mg/dl)、血清中存在异常脂蛋白时[Ⅲ型高脂血症(HLP)]时不宜采用Friedewald公式法计算。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究[3,5,19]。
    国外将临床常规实验室直接分离测定LDL-C的方法分为3代[5]。第1代为化学沉淀法，常用方法为肝素-枸橼酸钠法、聚乙烯硫酸沉淀法（PVS法）和多环表面活化阴离子法等[20~22]。这类方法主要缺点是TG水平较高（4.52mmol/L）时，有时因LDL沉淀不完全而使结果偏低。第2代方法有两类：一类为免疫分离法（Immunoseparation Method）[3，5，23~25]，美国Genzyme Diagnostics和Sigma Diagnostics公司已有可供临床应用的直接测定LDL-C商品试剂盒。即用PEG和结合有羊抗人apoE、apoAI多克隆抗体的胶乳珠分离试剂除去HDL(含apoAI/E)、IDL(含apoE)、VLDL(含apoE)及CM(含apoAI/E)，直接进行LDL-C测定水平。此法精密度好，准确度高，特别是对于低LDL-C浓度的测定结果准确。与-定量法有较好相关性，不受高TG水平的影响，可用于禁食或非禁食标本的检测。缺点是需专用分离管，试剂成本较高，难以自动化，且不适于冰冻或冻干标本的测定。可用于TG4.52mmol/L的少数患者LDL-C的检测，对于极少的Ⅲ型HLP患者LDL-C的测定亦有一定应用价值。另一类为简便的磁珠肝素分离法（美国Reference Diagnostics公司试剂）[26,27]，此方法不需离心，操作简便，精密度高，与Friedewald公式法相关性好，与-定量法结果一致。但此法所需标本量大，需特殊装置，特异性稍差，实验室较少应用此试剂盒。第3代为匀相测定法[3,5]，标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面都可达到NCEP 的分析目标。与之相比，国内第1代为电泳法；第2代为Friedewald公式计算法与化学沉淀法，1995年中华医学会检验学会在国内推荐此法作为LDL-C测定的常规方法[28]；第3代为目前广泛使用的匀相测定法。
    2.2  匀相测定法
    2.2.1 透射比浊法[3,29]  罗氏诊断（原Boehringer Mannheim）公司基于多聚阴离子试剂PAMPS与LDL颗粒发生特殊凝集反应设计而成的早期试剂。试剂1中的两性离子表面活性剂可使样品中HDL、CM和VLDL（富含TG）颗粒遮蔽。加试剂2[含触须状多聚阴离子（PAMPS）和两性离子表面活性剂]，在Mg2+存在下，LDL颗粒与PAMPS作用形成LDL-触须状多聚阴离子复合物，所产生浊度与LDL-C含量成比例。此法在某些自动生化分析仪上的应用受到一定限制。目前Roche公司已停止生产此类试剂，改用可溶性反应法。
    2.2.2 清除法（clearance method）
    2.2.2.1  表面活性剂清除法（surfactant LDL-C assay，SUR法）[3,5,30,31]   日本第一化学、Genzyme Diagnostics公司的LDL-C试剂盒均属此类方法，是国内外目前使用最广泛的一类试剂。试剂1中的表面活性剂 1能改变LDL以外的脂蛋白（HDL、CM和VLDL等）结构并解离，所释放出来的微粒化胆固醇分子与胆固醇酶试剂反应，产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时LDL颗粒仍是完整的。加试剂2（含表面活性剂2和偶联剂DSBmT），它可使LDL颗粒解离释放胆固醇，参与Trinder反应而显色，因其他脂蛋白的胆固醇分子已除去，色泽深浅与LDL-C量呈比例。
    2.2.2.2  过氧化氢酶清除法（catalase  LDL-C assay，CAT法）[5,30,32]   以日本Denka Seiken公司、英国RANDOX 公司和美国Polymedco公司试剂盒为代表。其原理为：第一步反应中，具有特异选择性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中CM、VLDL、HDL，所释放出的胆固醇在CHER和CHOD的催化反应下生成H2O2，H2O2被过氧化氢酶分解为H2O和O2。第二步，在另一表面活性剂的作用下，LDL颗粒中的胆固醇被释放出来，并与胆固醇酶试剂反应，用标准Trinder反应即可测定LDL-C。其试剂2中所含叠氮钠可抑制第二步反应中过氧化氢酶活性。此法在第一步反应中可除去非LDL颗粒的潜在干扰，试剂中特有的表面活性剂可减少高胆红素和高TG时对测定结果的影响。
    2.2.3  杯芳烃法（calixarene LDL-C assay，CAL法）[5,33]   为日本国际试药公司新近研制开发的一种检测试剂，尚未在全球市场广泛销售。其原理为：第一步反应中，试剂1中所含的表面活性剂杯芳烃（calixarene）可将LDL转换成可溶性LDL-杯芳烃复合物，血清中CM、VLDL、HDL颗粒中的胆固醇在CHER、CHOD的催化反应下，与肼作用生成胆甾烯酮腙。第二步，试剂2中的脱氧胆酸盐将可溶性LDL-杯芳烃复合物打破，LDL颗粒中的胆固醇被释放出来，并在β-NAD存在的情况下与CHER、胆固醇脱氢酶反应，生成胆甾烯酮腙和β-NADH，通过测定β-NADH的变化即可测出LDL-C含量。
    2.2.4  可溶性反应法（solubilization LDL-C assay，SOL法）[3,5,34~36]   此类试剂以日本协和公司和Roche公司为代表。试剂1含-环糊精硫酸盐、硫酸葡聚糖(DS 500)、MgCl2和EMSE，试剂2中含CHER、CHOD、POD、4-AAP和POE-POP。-环糊精硫酸盐在少量DS及Mg2+存在下，可减少CM和VLDL组分中的胆固醇与酶试剂的反应。多聚物聚氧化乙烯-聚氧化丙烯封闭共聚多醚（POE-POP）可减少HDL组分胆固醇的反应。两者结合则可选择性地测定LDL-C。
    2.2.5 保护性试剂法（protecting reagent LDL-C assay，PRO法）[5,36,37]  以日本和光公司和美国 Sigma Diagnostics公司试剂为代表。其原理是：第一步试剂1中含CHER、CHOD、过氧化氢酶、多聚阴离子和两性表面活性剂，后者可选择性保护LDL，防止其与胆固醇酶试剂反应。非LDL-C与CHER和CHOD的催化反应生成H2O2，H2O2被过氧化氢酶分解为H2O和O2。第二步，在另一非离子表面活性剂的作用下，LDL颗粒中的胆固醇被释放出来，并与胆固醇酶试剂反应，用Trinder反应即可测定LDL-C。

    3  对匀相测定法的技术要求
    3.1 对HDL-C测定的要求   对HDL-C测定而言，同一反应原理会有不同的试剂配方，而且这些配方也在不断地改进，还会不断涌现出新的方法与试剂。采用通过CDC CRMLN验证认可的匀相测定法试剂，使HDL-C临床测定更加便利、更加准确。常规应用时应按照仪器和试剂盒说明书采用双试剂、双波长测定，根据反应进程曲线确定读数时间。样品与反应总体积之比为1：100~1：150。根据试剂盒要求采取1点或2点定标。
    由于目前尚无HDL-C测定的决定性方法及1°级参考材料，使HDL-C 标准化工作难度大[2,38,39]。CDC-NHLBI的标准化程序对HDL-C检测的可接受限的目标进行了规定。要求检测准确度在CDC参考值(RV)的±10%以内，在小于1.03mmol/L(40mg/dl)、1.03~1.55mmol/L(40~60mg/dl)、大于1.55mmol/dl(60mg/dl)浓度范围内，HDL-C检测的最大不精密度分别为0.065mmol/L(2.5mg/dl)、0.078mmol/L (3.0mg/dl)、0.090mmol/L(3.5mg/dl)。NCEP1998年后目标定为为总误差13%；精密度要求HDL-C1.09mmol/L(42mg/dl)时，CV4%；1.09mmol/L时，CV0.044mmol/L(1.7mg/dl)。准确度要求偏差5%[2,6]。应用匀相测定试剂时还应注意下述问题：试剂盒配套用校准品应准确定值，采用CDC RM法进行准确性转移；校准物的定值应可溯源到已有的参考系统。特异性要高，高LDL-C, 高VLDL-C对测定结果基本无明显影响，回收率为90%~110%。最小检测水平至少为0.01mmol/L，线性上限至少可达2.59mmol/L（100mg/dl）。抗干扰能力应为：TG<5.65mmol/L(500mg/dl)、胆红素<513μmol/L(30mg/dl)、Hb<5g/L 时，对测定结果基本无干扰。采用参考方法或CRMLN DCM法进行方法学比较，相关系数r在0.95以上。未开封的试剂盒在2℃~8℃至少稳定6个月，开封后至少可保存1个月。
    3.2  对LDL-C测定的要求
    近年来相继报道一些新的匀相测定法检测LDL-C的试剂，并通过CDC CRMLN验证认可，使得LDL-C的临床常规测定更加方便，准确。临床应用时应按照仪器和试剂盒说明书采用双试剂、双波长测定，根据反应进程曲线确定读数时间。样品与反应总体积之比为1：100~1：150。根据试剂盒要求采取1点或2点定标。
    目前国内外尚无LDL-C测定的决定性方法与1°级参考材料，NCEP推荐CDC的-定量法为参考方法，2°级参考材料为CDC冰冻血清(NIST SRM 1951a，CAP RM 026)[38,39]。NCEP暂推荐CDC的-定量法为参考方法，Friedewald公式法为常规方法[3,19]。1995年开始我国根据国内实际情况，在广大临床实验室中广泛推广化学沉淀法(如PVS法)直接测定LDL-C，这样可防止临床应用中因测定结果不准确而造成的混乱。近年来各种匀相测定法试剂因简便、快速，精密度高，易于自动化而为广大临床实验室所接受。应用匀相测定试剂时还应注意下述问题：试剂盒配套用校准品应准确定值，采用CDC RM法进行准确性转移；校准物的定值应可溯源到已有的参考系统。NCEP对LDL-C测定的分析目标进行了规定，要求总误差12%；不精密度要求CV4%，不准确度要求偏差4%(与-定量法测定参考值比较) [3,19]。与参考方法或CRMLN DCM法进行方法学比较结果应基本一致（相关系数r在0.95以上）。特异性要好，高HDL-C、VLDL-C对测定基本无明显影响，回收率为90%~110%。线性范围要宽，最小检测水平至少为0.01mmol/L，检测上限至少为7.77 mmol/L (300mg/dl ) 。抗干扰能力强：TG<5.65mmol/L (500mg/dl) 、胆红素<513μmol/L (30mg/dl)、血红蛋白<5g/L时，对测定结果基本无干扰。未开封的试剂盒在2℃~8℃至少稳定6个月，开封后至少可保存1个月。