解放军总医院临检科   丛玉隆

    人类正以豪迈的步伐进入21世纪。作为检验医学工作者，直面一个被称为生命科学世纪和生物技术世纪的新时代，如何抓住机遇，乘热而上，加强检验医学领域各分支学科建设，促进检验医学全面发展，是值得认真思考和研讨的重要课题。近十几年来，随着血栓性疾病与出血性疾病在人类疾病谱中地位的变化及防治研究的迅速进展，血栓与止血的实验诊断技术也不断有新的发展并在全国逐步普及。但由于试验的标准化程度尚不够高，试验的质量控制也有待改进。清楚地了解血栓与止血实验诊断的现状和存在的问题，将有助于这项工作的进一步发展，特作概略评述。

一、血栓与止血试验的标准化
　　血栓与止血试验的标准化是指对检测标本、试剂、仪器、技术和操作等制定统一标准，按照标准的要求对试验进行科学管理，以减少误差，提高试验的精密度、准确性和可靠性。由于血栓与止血试验的特殊性，迄今关于血小板功能、抗凝因子、纤溶成分的检测尚缺乏成熟的标准化方案，仅在凝血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APTT）和纤维蛋白原试验（Fg）3项试验，国际血液学标准化委员会（ICSH）、国际血栓与止血委员会（ICTH）或美国临床生物化学标准化委员会（NCCLS）有较明确的规定。对于PT试验，规定：（1）用不同级别的凝血活酶国际参考品（如原级凝血活酶参考品67/40，次级参考品68/434等），校正本土制备或生产的组织凝血活酶参考物，本土生产的凝血活酶试剂必须标有国际敏感指数（ISI）值；（2）结果的报告方式弃用“活动度”，采用“秒（s）”和“患者PT与正常PT比率（PRT）”，在口服华法林类药物监控时，采用“国际标准化比值（INR）”。对于APTT试验，推荐的方法与仪器要求基本同PT试验。但应该注意，不同的部分凝血活酶、不同的活化剂和不同的激活时间，对各种因子缺陷、对肝素和狼疮抗凝物质的敏感性差异很大，应根据不同的检测目的选择相应敏感的凝血活酶或活化剂。对于纤维蛋白原试验，世界卫生组织的生物标准化委员会已将1992年问世的纤维蛋白原标准品89/644定为国际参考品（IRP），并推荐采用改良Jacobsson法和IRP来标准化本地区的次级标准品。在常规纤维蛋白原含量测定时建议使用Clauss法。需要注意的是，目前国内使用的某些仪器可以根据PT的变化换算出纤维蛋白原含量，这种方法只能对纤维蛋白原含量作出大致估计，当含量明显异常特别是明显减低时，不能准确判断。
根据手术前出血、凝血时间测定结果预测患者是否会术中出血，一直存在争议。20世纪90后代初，Lind在著名的《Blood》杂志上直截了当地用《出血时间不能用于预测外科手术是否出血》的标题阐述其观点。Rodgers通过对862篇文献的复习，也得出同样的结论。指出尽管出血时间对评价血小板及血管功能有一定价值，但用它来预测外科手术是否出血，没有什么意义。我国的专家也进行了多次研讨。2000年7月，中华医学会检验医学分会和血液学分会共同起草文件给卫生部临床检验中心，提出“终止使用一般外科手术前的常规出凝血时间检测，建议用活化的APTT、凝血酶原时间试验和血小板计数联合检测，如临床有出血史时另加模板式（出血时间测定器）法进行出血时间检测”。据悉，国家卫生部将批准并下文件建议执行。

二、血栓与止血试验的分析前质量控制
　　血液标本的采集、运输和处理是否得当对试验结果有直接影响，因此是分析前质量控制的重要环节，但是这些环节经常被忽略或不易标准化，日常工作出现“难以解释”的试验误差常与这些环节有关，必须注意。
1. 标本的采集：尽可能保证每次采血都在同样的条件下进行。患者应处于平静和空腹状态。采血人员应技术熟练,“一针见血”，以防损伤组织致外源凝血因子进入试管，影响试验结果。止血带不应扎得太紧，采血时间应尽量短。采血后立即将血液与抗凝剂充分混匀，但不要用力振荡，以免溶血。建议使用真空采血系统，可颠倒混匀，确保血液和抗凝剂混合充分。也可以一次静脉穿刺后，将所采集的第1管血用于血生化等其他检验，第2管血用于血栓和止血试验。常用抗凝剂为0.109mol/L枸橼酸钠，它能有效地阻止因子Ⅴ、Ⅷ的降解，并可稀释血浆和血液，但需严格按1：9比例抗凝。由于“1：9”的概念是指1份抗凝剂对9份血液中的血浆而言，当患者的红细胞压积大于0.55时，枸橼酸钠的浓度需要校正。可用NCCLS推荐的经验公式进行校正：X=（100-PCV）/（595-PCV）。式中X是单位体积血液所需的抗凝剂体积数PCV以以百分数表示的红细胞压积。对需要经冷冻保存后再行分析的标本，推荐使用缓冲抗凝剂，因为无缓冲剂，血浆pH值随时间而增加，凝固时间可延长，特别是Ⅷ因子，即使是-20℃保存，其凝血活性也可减少50%。做血小板功能和肝素检测，推荐使用CTAD液（枸橼酸钠0.11mol/L,茶碱15mmol/L,ERI AAF 3.7mmol/L，潘生丁0.198mmol/L）处理标本。做纤溶试验划进行溶栓治疗时，应在普通抗凝剂中加入抑肽酶，以抑制纤溶活化。
2. 标本的运输：最好在实验室内采血，或尽快送至检测地点，严防剧烈振动、日光直射和异物落入。有些检测项目（如β-血小板球蛋白、血小板因子Ⅳ和凝血因子等）需在4℃条件下运送标本，以防止因子Ⅴ和Ⅱ的降解。
3. 标本的处理：标本应尽快离心。一般在15-20℃离心，但纤溶试验需在4℃左右离心。溶血的血浆会引起血小板活化和凝血时间缩短，应弃之不用。血浆标本原则上应立即检测，否则应低温保存。标本的保存时间与保存温度有关，22-24℃保存存2h，2-4℃保存4h，-20℃保存2周，-70℃保存6个月。

三、开展循证检验医学研究，加强实验室与临床的信息交流
　　循证检验医学研究的目的是：（1）采用循证医学的模式评价检验指标的临床意义，确定其诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和合适的临界值。（2）加强对临床诊断和治疗的指导作用，开发新的检验项目，评价其应用价值。（3）适应卫生经济学要求，筛选可靠指标，剔除不合理或无重要诊断、治疗或预后参考价值的检验项目，减少资源浪费，减轻病人负担。（4）收集大规模临床随机对照试验得出的可靠结论，不断修订实验室指标的判断标准，再用以指导临床实践。血栓与出血的形成是多因素、多系统病理生理变化的结果，涉及到血管内皮、血小板、凝血因子、抗凝因子、纤溶系统及血液流变学的变化。这些因素是“对立统一”的。所谓“对立”，是指它们的功能是相反的，有的促凝、有的抗凝；所谓“统一”，是指诸因素在神经和体液的调节下，达到平衡，保持健康生理状态。一旦平衡被打破，或是形成血栓，或是出血不止。血栓的形成可人为地划分为血管反应期、血小板粘附及血小板栓子形成期、纤维蛋白形成微血栓期、血管修昨及纤溶期，但这是一个动态的、连续的过程，各期是交错的，调节是对立的，在实验诊断时往往需要几个指标组合，进行综合分析。因此，要通过循征检验医学的研究，确定处于不同病期、不同病理状态的不同类型疾病的最佳实验诊断项目组合。既不要凭借某一项参数的变化，单一地、孤立地、静止地分析问题，更不要不顾病人负担，“大撒网”式多项目或全项目检测，造成浪费。为此必须要求技术人员对血栓和止血机制有深入的了解，掌握各项试验的原理和临床意义，掌握相关疾病的病理生理基本知识，并不断地与临床医生进行学术交流和信息沟通，比如同样的血小板聚集试验，二磷酸腺苷（ADP）诱导对地可利得监测最合适，花生四烯酸诱导更适合阿司匹林用药监控。而诊断血管性假性血友病则必须使用瑞斯托霉素诱导。同样是APTT试验，肝素监测使用硅藻土作活化剂更敏感，因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等检测宜用白陶土作活化剂，而以鞣化酸为活化剂的APTT对狼疮抗凝物质更具特异性。可见，如何在医疗实践中发现止血与血栓试验的“适应证”，寻求最合理、最直接、最可靠、最有意义、最经济、最有的放矢的检验项目组合，是循证检验医学的主要内容。

四、抓住机遇，积极开展血栓的实验诊断工作，促进检验医学的发展
　　血栓性疾病，尤其是心、脑血管血栓性疾病，已成为我国人口病死原因的第一位，而且发病率有所增加，严重危害人类健康。血栓与止血研究的飞速发展，促进了对血栓性疾病发病机制的深入认识，从而推动了血栓性疾病实验诊断技术的进步。
　　近10年来，随着基础医学的深入研究，高科技在医学领域的应用，各型号的自动凝血仪逐步普及。先进的仪器同机具备生物学、生物化学及免疫学三种检测系统，既可利用纤维蛋白原转变成纤维蛋白的瞬间物理特性的变化检测凝血因子活性，又可利用“酶底物显色法”检测参与凝血过程的酶、酶原及酶原抑制物，还可通过免疫方法定量假性血管血友病因子（VWF）、D-二聚体等含量；新型的血小板聚集仪不但可较精确地行全血、血浆的血小板聚集功能检测，还可观察血小板钙、血小板ADP释放、模拟人体内止血过程的血小板功能仪，准确、客观地解决了评价血小板粘附功能的问题。POCT(point of care test)的发展，使ACT、APTT、PT、D-二聚体的测定可以在床边进行，方便了临床和病人。到20世纪末，随着基因克隆技术日趋成熟，所有在凝血过程中起作用的凝血因子cDNA和基因都已被克隆出来，将为研究凝血因子蛋白质的结构、功能、生物合成开辟新的途径。基因芯片的应用为某些遗传性出血性疾病（如血友病）提供了快速的诊断手段。
　　血栓与止血的研究涉及生物学、免疫学、生化学、病理生理学、药理学、分子生物学及临床医学多学科。因此，检验科应积极开展血栓与止血实验诊断工作，不断深入进行基础研究和临床实践，及时捕捉国内外医学发展前沿信息，不断引进新方法、新技术、拓宽专业领域，对于提高检验医学工作者的技术素质和学术水平，促进检验医学的学科建设与发展，将起到重要的推动作用。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　摘自：《中华检验医学杂志》2001年1月第24卷第1期