广东省SARS流行株M基因序列分析

　　周惠琼　郑夔　江立敏　郑焕英　方苓　张欣李晖　陈秋霞　黄平　黄吉城　万卓越

摘要：
目的　测定广东省不同流行时期13份SARS病毒（SARS CoV）标本的M基因序列，通过分析该基因序列的变异情况，初步了解广东省SARS病毒在流行过程中是否发生了变异。

方法　提取病毒RNA，用M基因特异引物进行RT-PCR，将产物纯化后直接测定核苷酸序列。

结果　13份标本M基因核苷酸序列同源性很高，为99.7%～100%，M基因核苷酸序列只在2个位点（80和203位）发生变异，1株80位点的变化引起编码的氨基酸从苯丙氨酸（F）变为半胱氨酸（C），3株203位变化为无义突变。

结论　M基因核苷酸序列变异不大，初期和后期M基因核苷酸序列与流行高峰期的毒株相差1个碱基，但氨基酸序列相同；从香港感染病人分离的1株病毒M基因与广东本地感染分离株存在1个氨基酸的差异。

关键词：SARS CoV；M基因；序列分析

非典型肺炎，国外也称之为严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS），是一种急性呼吸道传染病，广东省是世界上最早报告此病的地区；从2002年11月16日起到2003年7月10日止，全省累计报告SARS病例1512例，死亡58例，其中，广州报告病例1300例，占85.99%；发病的高峰是2月的中上旬。短短几个月，SARS疫情波及全球30多个国家和地区。

加拿大和美国最早完成SARS病毒基因组测序，测出的基因序列长度分别为29751bp和29727bp，M基因序列从26398bp到27063bp，编码221个氨基酸；M蛋白是SARS CoV的结构蛋白，横穿包膜，与病毒转膜、出芽和包膜形成有关。到7月17日止，GenBank完整的基因组序列达28条，但最早报告此病的广东只有1条（AY278489 GZ01）。广东省SARS病毒在流行的早期（1月）、高峰期（2月）、后期（4月）基因组是否相同，为此，我们测定了不同流行时期13份SARS病毒（SARS CoV）M基因序列，通过分析该基因序列的变异情况，初步了解广东省SARS病毒变异程度。

材料和方法

标本：广东省临床诊断为SARS病人的咽嗽液、尸检肺组织和Vero-E6细胞分离株，标本经用WHO推荐的罗氏引物（BNIoutS2/BNIoutAs,BNIinS/BNI-inAs）和中山大学达安公司荧光定量PCR试剂鉴定均为SARS CoV阳性，标本来源见表1。
表1　13份SARS CoV标本的来源
Table 1.The origin and collection time of 13 SARS CoV samples

No.	Pro-number	Collection site	Date of onset	Collection date	Type of sample
GD01	Z-7	Zhongshan	2003.1	2003.1	Vero-E6 isolates
GD02	UP53	Guangzhou		2003.2.11	Lung tissue
GD03	Y2-19	Guangzhou		2003.2.11	Vero-E6 isolates
GD04	Y2-3	Guangzhou	2003.2.5	2003.2.11	Vero-E6 isolates
GD05	Y2-16	Guangzhou	2003.2.8	2003.2.11	Vero-E6 isolates
GD06	Y2-14	Guangzhou	2003.2.9	2003.2.11	Vero-E6 isolates
GD07	SZ-5	Guangzhou	2003.2.11	2003.2.14	Vero-E6 isolates
GD08	SZ-7	Guangzhou	2003.2.11	2003.2.14	Vero-E6 isolates
GD09	UP-179	Guangzhou	2003.2.13	2003.2.22	Vero-E6 isolates
GD10	51	Guangzhou	2003.2.15	2003.3.1	Throat-Washingw
GD11	2	Guangzhou	2003.2.21	2003.2.25	Throat-Washingw
GD12	F80	Jiangmen	2003.4.5	2003.4.9	Vero-E6 isolates
GD13	F-69	Jiangmen	2003.4.1	2003.4.9	Vero-E6 isolates

RNA提取：采用QLAGEN公司（QIAamp Viral RNA mini Kit）。
引物：M-F：5＇-CTATTATTATTATTCTGTTTGGAAC-3＇；M-R：5＇-AACAAGATGAAACATCTGTTGTCAC-3＇。
RT反应：采用QIAGEN Sensiscript Reverse Tran-scriptase，反应条件：37℃ 60min,95℃ 5min。
PCR反应：采用TaKaRa公司TaKaRa PyroBest Taq。反应条件：93℃ 2min,93℃ 45 s,58℃ 40 s,72℃1min,3个循环；93℃ 40 s,60℃ 40 s,72℃ 10 min,30个循环。
PCR产物纯化：采用QIAGEN Gel Extraction Kit。
测序：用ABI PRISM○R BigDyeTM Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequence Kit进行测序反应，产物纯化后，在ABI PRISM○R3100 Genetic Analyzer 自动分析仪上自动完成。具体操作参考ABI操作方法。从两个方向进行测序，用DNASTAR软件分析结果，并与GenBank数据库进行比较分析。

结　　果

1.RT-PCR结果：从2份（GD02、GD10）广东省临床诊断为SARS病人的咽嗽液、1份尸检肺组织（GD02）和10份用Vero-E6细胞分离培养阳性的标本中提取病毒RNA，用M基因特异引物进行RT-PCR反应，结果扩增出与预期大小相符的目的片段，长度为700bp左右，结果见图1。从图1中看出，从SARS病人的咽嗽液、尸检肺组织也能扩出M基因片段，所以M基因特异引物应可用于对SARS病人的诊断。

图1　RT-PCR扩增得到M基因片段
Fig1.RT-PCR products of the M gene of SARS-associated virus
M:DNA molecular weight marker(DL2000)

2.M基因核苷酸序列分析：测出的M基因核苷酸序列长度为666个碱基，13份不同时间、不同地点采集的标本M基因同源性很高，为99.7%～100%,变异不大，13份标本M基因只在2个位置（80-203）上的碱基发生替换，在80位有12份的碱基是T，只有GD13是G；在203位，GD01、GD02、GD12的碱基是C，其它10份都是T；13份标本M基因核苷酸序列替换情况见表2。
表2　13份标本M基因核苷酸序列替换情况
Table2. The sites of nucleotide substitution in 13 samples

No	Nucleotide location
No	80	203
GD01	T	C
GD02	T	C
GD03	T	T
GD04	T	T
GD05	T	T
GD06	T	T
GD07	T	T
GD08	T	T
GD09	T	T
GD10	T	T
GD11	T	T
GD12	T	C
GD13	G	T

根据碱基的差别将核苷酸序列分成3组，GD13为一组，GD01、GD02、GD12为一组，其余9份为一组；3组核苷酸序列与GenBank上部分SARS CoV序列基因发生树见图2（TOR2：AY274119，HK01：AY278491，GZ01：AY297028，BJ01：AY278488，HK03：AY282752）。

图2　3组不同的M基因核苷酸序列与GenBank上部分SARS CoV序列基因发生学分析
Fig2. The phylogenetic analysis of the sequences

    GD13 M 基因核苷酸序列与HK03相差1个碱基（203位C→T），目前GenBank中还没有与GD13相同的M基因核苷酸序列；GD01、GD02和GD12的M基因序列与广州（GZ01）、北京（BJ01）、多伦多TOR2相同；其余9份标本M基因序列与HK01相同。

    3.M基因氨基酸序列分析：将核苷酥序列翻译成氨基酸序列，12份广东内地标本氨基酸序列相同，GD13毒株在80（核苷酸序列）位相对应的氨基酸是C（半胱氨酸），其余12份在该位置是F（苯丙氨酸）。

讨　　论

    M基因在广东省1～4月中流行变异不大，所测的12份广东本地流行株M基因核苷酸序列只有1个位点（203位）的碱基发生了替换，但并未导致此处的氨基酸发生改变，最早（1月）在中山（GD01）、广州（GD02）和4月份在江门（GD12）流行的病毒M基因序列相同。GD01、GD02和GD12（第一代发病时间是4月初）可能都是三代以内的病例。GD02患者，2003年1月31日发病，2月11日死亡。

    2003年2月份在中山二院、广州第八医院、省中医、广州市第一医院、广医附一院的9份标本所测的M基因序列相同，2月份是广东SARS流行的高峰时间，这类毒株传染的人数最多，病例代数较高，但目前GenBank上公布的序列，多与此序列不同。
GD13毒株在80位的碱基是G，相对应的此处的氨基酸也由F变成了C（半胱氨酸），该毒株在Vero-E6细胞上培养很快引起细胞病变，电镜照片上可观察到大量病毒颗粒，这一改变可能加快了病毒装配和细胞内芽生的速度，使病毒大量繁殖，增强了感染力。GD13毒株分离自香港患者，家住淘大花园对面，回江门探亲后病故，香港淘大花园SARS病人的死亡率偏高。GD12、GD13都是4月上旬在江门发病，但由于受感染地区不同，M基因氨基酸序列发生改变，香港和广东内地流行的有些SARS CoV病毒毒力和引起的临床症状是不同的。目前国内毒株还没发现（80位核苷酸对应的氨基酸）有C的毒株。

    本次流行的M基因与人冠状病毒229E（|NC-002645）、Bovine(NC-003045)、Porcine(AF 481863)、Rat(AF088986)M基因的同源性比较低，在27%～41%之间，而本次在广东佛山、河源、中山、江门的首例病人互相间都没有接触史。从流行病学系统研究传染源，调查SARS CoV流行后，在人间是否存在隐性感染者，是否还会引起新一轮的流行，均为亟待研究的课题。