流式细胞术测定血小板聚集探讨

目的　评价流式细胞术测定血小板聚集的方法，探讨其质量控制。

方法　体外以ADP活化全血或富血小板血浆（PRP）血小板聚集，再以荧光抗体CD61 PerCP标记活化血小板，行流式细胞术分析，相对计数单个血小板数量，以单个血小板数量`的减少衡量血小板聚集率的大小。并进行方法学评价及质量控制问题的探讨。

结果　流式细胞术测定全血或血浆血小板聚集的方法具有较高的重复性；与传统的浊度法测定比较，结果相关较好，测定的敏感性高于浊度法；测定结果与标本类型、血小板数量、检测温度以及对反应体系的搅拌等因素有关。

结论　流式细胞术测定血小板聚集是一项准确、敏感的检测方法。

血小板聚集是动脉血栓形成的重要过程，常规方法是在富血小板血浆（PRP）中加入不同的外源化学诱导剂，根据反应体系浊度的变化来反映血小板聚集率。这种检测方法方便、经济，但是因其采用浊度法原理，检测的重复性存在一定的缺陷，有必要寻找更为敏感、准确的血小板聚集测定方法。本实验用血小板特异性荧光抗体标记血小板，流式细胞术（FCM）计数单个或聚集的血小板颗粒的方法测定血小板聚集率，并进行了方法学评价和质量控制因素的探讨。

1　材料和方法

1.1　试剂　（1）CD61 PerCP，为多甲藻素-叶绿素蛋白标记的抗血小板GPⅢa的单克隆抗体（McAb）,美国Becton-Dickinson公司；（2）固定液，1%多聚甲醛（PFA），美国Sigma公司，（3）0.2 mmol/L的ADP，美国Biopool公司；（4）38g/L枸橼酸钠抗凝剂。

1.2　仪器　（1）FACSort流式细胞仪，美国Becton-Dickinson公司；（2）血小板聚集仪，美国CHRONO-LOG。

1.３　标本采集　用８号针管采取两周内未服用任何药物、无心脑血管疾病的健康者静脉血，38g/L枸橼酸钠抗凝（1∶9），混匀后立即进行实验。抽出的前2ml血弃去。根据需要，常规方法分离制备PRP、乏血小板血浆（PPP）。标本采集后2h内完成检测。

1.4　流式细胞术测定血小板聚集率　取未加ADP及ADP活化的全血或PRP标本5μl，加入10μlCD61 PerCP，轻轻混匀，室温避光染色15 min；加入1 ml冷的（2℃～8℃）固定液1% PFA，充分混匀；置4℃固30 min后进行流式细胞术分析。以未加ADP标本为血小板零聚对照。ADP活化后标本中单个血小板数量的减少反映血小板聚集率的大小。为了与聚集仪测定比较，血小板活化性聚集仪中进行，即反应温度37℃，1000 r/min搅拌；诱导剂一般为20 μmol/L ADP,活化时间为5 min（使血小板聚集达最大）。

1.5　方法学评价与质量控制台　（1）重复性：用于FCM方法测定一份健康者全血标本的血小板聚集率，同样条件下测定10次；另取10份健康者全血标本，每份标本分别测定两次。（2）灵敏度：用FCM与血小板聚集仪两种方法同时测定不同浓度ADP（0.5～20μmol/L诱导的健康人PRP标本的血小板聚集率。（3）其他因素对测定结果的影响：包括标本类型、标本中血小板数量、检测温度及对反应体系的搅拌等。

1.6　数据统计分析　所有实验数值以均数±标准差( x±s)表示，以t检验、方差分析方法进行统计学处理，P<0.05表明差异有统计学意义。用SAS统计分析系统完成处理过程。

2　结果

2.1　FCM测定血小板聚集率　FCM分析加ADP前后的标本，以CD61 vs SSC参数设定血小板门R1细胞群，以CD61vs FSC参数分析R1门中血小板聚集情况；流式细胞仪可自动计算出图R3门中血小板占总血小板的百分率，即为血小板聚集率。

2.2　重复性测定　一份健康者全血标本的血小板聚集率（20μmol/L
ADP诱导）为（59.6±2.3）%(n=10),变异系数CV为3.9%。10份健康者全血标本重复性测定两次血小板聚集率分别是为(52.1±8.7)%、(49.8±7.9)%，二者比较P>0.05。

2.3　FCM与聚集仪测定血小板聚集的敏感性比较
两次同时测定健康者PRP（n=10）的血小板聚集率。随着诱导剂ADP浓度的增加，血小板聚集率也逐渐增加。并且两种方法测定的结果有较好的相关性，相关系数r=0.95,P=0.01。但是在各种诱导剂浓度下，FCM测定的结果均高于聚集仪测定的结果（P<0.05）。

2.4　标本类型为测定的影响　用FCM方法测定健康者全血[PLT为（155～249）×109/L]及其PRP[PLT为（232～340）×109/L]的血小板聚集率（诱导剂20μmol/L ADP），结果全血标本聚集率为（51.2±6.4）%，低于PRP测定结果（61.8±5.5）%(n=10,P<0.05)。

2.5　血小板数量对测定的影响　取血小板计数250×109/L的全血，以其自身PPP调节达所需血小板数量，测定结果见表1。

2.6　检测温度对测定的影响　全血标本直接（室温25℃）或在37℃下测定，结果室温下血小板聚集率为（54.7±5.5）%，37℃为（51.2±6.4）%，差异无统计学意义（n=10,P>0.05）。

2.7　反应体系的搅拌对测定的影响　FCM方法测定全血小板聚集，分别在聚集仪的标本槽中磁棒以1000r/min速度搅拌、人工混匀反应体系两种情况下测定。结果搅拌下测定血小板聚集率（51.2±6.4）%,而人工混匀下测定结果为（42.9±4.5）%,二者比较差异有统计学意义（n=10,P<0.05）。

3　讨论

    CD61是血小板膜糖蛋白GPⅢa，正常表达于所有血小板的表面。本实验中采用荧光标记的抗CD61特异性McAb标记血小板，在FCM分析时能特异地识别几乎所有的血小板，优于一般血液分析仪检测。SSC反映细胞形状、颗粒特性，因此在识别血小板时采用CD61 PerCP、SSC参数；在分析血小板聚集时采用CD61 PerCP、FSC参数，因为后者反映细胞粒子的大小，所以更容易分清是单个血小板还是聚集血小板。直接以未活化标本作为划分单个和聚集血小板的标准，一般情况下是可行的。如果待测标本存在病理性自身聚集或体外人为活化致聚集，就需用一定大小的标准磁珠来定标。一般认为4.5～５μm是单个和聚集血小板的分界线，也有人将5～10μm之间的血小板粒子称为“微聚集”，而大于10μm的才称为血小板聚集体。应用全血标本检测，避免了体外分离标本导致的人为活化，所以本实验中采用的方法在血小板平均体积有差异的时候有其优越性。ADP活化后的标本，CD61 PerCP荧光强度有所增强，可能是因为活化血小板GPⅡb/Ⅲa表达增加所致。R3门中少量低荧光强度的阳性粒子，可能是与白细胞黏附的血小板，也可能是由于血小板与红细胞同时通过FCM检测区，仪器误认为是一个大的阳性血小板。但是由于其所占比例较低，一般不超过5%（本实验为3%左右），并且在血小板活化前后变化较小，所以血小板聚集率的计算结果基本没有影响。

    对本法的评价结果表明，FCM测定血小板聚集具有较高的重复性，与传统的浊度法有较好的相关性，因而能满足临床检测的需要。FCM敏感性高于浊度法，尤其是低浓度的诱导剂更为明显，可能是因为FCM能够检测到很小的血小板聚集体，而浊度法则做不到。因此，FCM法可能准确地定量评价血小板功能减低患者的血小板聚集功能。全血测定结果比PRP要低，一方面是因为全血中大量的血细胞可能干扰了血小板相互作用，另一方面全血的血小板数量比PRP要低。其他如测定温度、对反应体系的搅拌也是测定时需要考虑的问题。

    FCM测定血小板聚集，不但可以提高检测的精度，还可进一步分析聚集的大小分布情况；结合其他荧光抗体或染料，可同时分析活化过程中血小板表面物质的变化，促凝微粒的释放，血小板Ca2+的变化等。但是FCM也有不足之处：因为血小板大小不均质性，有可能几个小血小板组成的聚集体大小还在设定分界线内，所以测定结果可能比实际要偏低；不能象聚集仪那样动态分析血小板聚集的过程；流式细胞仪及实验材料较为昂贵，尚不能作为常规应用。另外，本研究中多为手工操作，尤其是微量检测，势必会影响检测的效率和准确性，所以尚不能满足临床检测的需要。因此，必需进一步完善本实验方法，或者开发研究基于此原理的自动化检测设备，使其应用于临床工作之中。