高耀华、廖小林、范维珂
重庆市中医研究所、重庆医科大学病理生理教研室

    肝纤维化是肝脏慢性损伤后的愈合反应，肝星状细胞（HSC）的活化和细胞外基质（ECM）合成增多而降解不足是该病理生理改变的中心环节。目前抗肝纤维化都是从四个方面进行，即抑制ECM合成、促进ECM降解、促进HSC凋亡与阻止肝窦毛细血管化。医学研究显示，肝纤维化病理过程中所产生的ECM成分、细胞因子以及基质金属蛋白酶（MMP）及其抑制物等生化指标对肝纤维化病理变化显示出一定的敏感性，在疗效的评判中有一定价值；而且由于肝活检组织学检查的创伤性及适应范围的受限，这些无创的实验室生化检测指标在当前抗肝纤维化研究中起着重要的作用。

1  ECM的生成降解与生化指标

    1.1  ECM的生成  HSC的活化为ECM产生的关键。慢性肝损伤后激活的HSC大量增殖，失去维生素A经表型转化为平滑肌α肌动蛋白阳性的成纤维细胞，产生各种各样的胶原及非胶原ECM蛋白。ECM由四部分组成：主要包括：（1）胶原蛋白类：①间质胶原（包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）；②基膜胶原（Ⅳ型）；③细胞外周胶原（V型）。肝内已肯定有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V型胶原。（2）非胶原糖蛋白：以纤维连接蛋白（FN）和层粘蛋白（LN）为主。（3）蛋白多糖：如硫酸皮肤素、硫酸肝素和透明质酸（HA）等。（4）弹性蛋白。其中胶原是构成ECM的重要蛋白质。HA、PCⅢ、LN、CⅣ主要由肝星状细胞产生，HA、PCⅢ是肝窦内皮细胞通过膜受体摄取和降解的。在肝纤维化时，肝窦内皮细胞表型发生改变，血清HA、PCⅢ有不同程度升高；而LN、CⅣ在Disse间隙沉积增加，形成基底膜。早期损伤为Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白（FN）聚集在Disse腔，慢性肝损伤时Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白、粗纤维调节蛋白、层粘蛋白（LN）大量沉积，HA明显增高。所以肝纤维化早期表现Ⅲ型胶原沉积过多，晚期为Ⅰ型胶原、HA增多。Ⅲ型前胶原肽PⅢP是Ⅲ型前胶原经氨基端肽酶作用脱下的多肽，PⅢP由PCⅢ裂解入血，血清PⅢP水平的增加反映PCⅢ合成旺盛。

    1.2  ECM的降解
    1.2.1  MMP/TIMPs与ECM降解  ECM的降解依赖于ECM降解蛋白酶，现有三大酶类：基质金属蛋白酶类（MMPs）、丝氨酸蛋白酶类及半胱氨酸蛋白酶类。大量资料表明MMPs在ECM降解中起关键作用，而纤溶酶在丝氨酸蛋白酶类中占主导地位。目前，人体已发现的MMP有17种。按照作用底物不同，MMP可分为4类：（1）胶原酶，分为间质胶原酶（MMP-1）、中性粒细胞胶原酶（MMP-8）和3型胶原酶（MMP-13），主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型间质胶原。（2）基质溶解素（包括MMP-3、MMP-10、MMP-11及MMP-7），主要作用于蛋白多糖等。（3）明胶酶/Ⅳ型胶原和变性胶原及弹力蛋白等。（4）膜型金属蛋白酶（含MT-MMP1及MT-MMP2）：位于细胞的表面，主要与MMP-2的激活有关。人体内表达最多的是MMP-1、MMP-1是间质胶原酶的代表酶，特异性分解肝脏Ⅰ、Ⅱ型胶原的胶原酶，广泛存在于包括肝脏在内的人体组织内。MMP-2是Ⅳ型胶原酶的代表，又称明胶酶A，主要分解Ⅳ型胶原及明胶，肝细胞外基质降解的关键酶是MMPs家族。MMPs可在多水平上受到多种方式的调节，从而影响ECM降解。细胞因子、激素、生长因子、化学药物、生理应激、肿瘤细胞转化等都可以增强MMPs基因的表达，如TNF-α、PDGF、bFGF、干扰素α、干扰素γ、IL-1α、IL-1β；而增强的基因表达又可以被抑制因子所下调，如TGF-β、视黄酸、糖皮质激素等。TIMPs是组织中MMP主要的内源性抑制因子，现已发现四种TIMPs，对目前已知的MMPs均具有抑制作用。TIMP-1可与MMP-1、MMP-3结合形成1∶1化合物。TIMP-2亦可与MMP-1、MMP-2和MMP-3呈1∶1结合。TIMP-1和TIMP-2除能与活性MMP结合抑制其活性外，还能以非共价形成与明胶酶原结合，与明胶酶原结合的TIMP-1或TIMP-2仍然能抑制MMP的活性，提示TIMP可与明胶酶原、MMP形成三联复合体。TIMP-1及TIMP-2通过N末端结合MMP而形成复合体，不可逆地抑制MMP的活性，TIMP-3以不溶性形式与ECM结合，也能抑制各种MMP活性。TIMP的下调成为ECM降解的重要因素。MMP/TIMPs的平衡在肝纤维化形成过程中起着至关重要的作用。研究证实，血清TIMP-1与血清PⅢP、Ⅳ型胶原密切相关，而血清TIMP-1对肝纤维化的早期诊断有一定价值。

    1.2.2  PA/PAI与ECM降解  除了基质金属蛋白酶类，丝氨酸蛋白酶类在ECM降解中也起着重要作用，纤溶酶是后者的主要组成部分。纤溶酶原激活物（PA）包括组织型和尿激酶型（tPA和uPA），它们是机体纤溶系统的主要组成成分。纤溶系统的功能有三：（1）保持血流畅通；（2）溶解伤口或炎症病灶局部的纤维蛋白凝块而促进伤口愈合和组织修复；（3）溶解结缔组织。tPA主要参与纤溶过程，溶解血栓，防止血栓形成，使血管再通。uPA主要作用于生理病理条件下细胞迁移、组织重建、肿瘤侵润及转移过程，其中包括细胞外基质降解过程。uPA可激活纤溶酶原成为纤溶酶，两者均为丝氨酸蛋白酶，可以直接或经激活胶原酶降解ECM及基底膜中胶原成分。纤溶酶原激活抑制剂（PAI）是tPA和uPA特异快速的生理抑制物，且血浆中PAI-1具有肝源性。酶原活化过程的调节：MMPs以无活性的酶原形成分泌到细胞外，由体内最主要的激活系统PA激活。PA的激活有赖于尿激酶-纤溶酶原激活系统（uPA）,uPA的活性被血浆纤溶酶原激活物抑制物（PAI）抑制。PAI-1含量还与TGFβ呈正相关，随着肝纤维化的加重而增加。TGFβ能上调PAI，下调PA，从而抑制MMP的激活。肥大细胞类胰蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶及反应性氧中间产物等可单独或与血浆纤溶酶共同参与MMP的激活过程。

    1.2.3   HSC与ECM降解  大量资料表明HSC也参与肝纤维化基质降解，具体表现为：（1）分泌MMP促进ECM降解；（2）表达TIMP；（3）合成释放uPA及PAI-1；（4）活化HSC的凋亡；（5）合成α2-巨球蛋白。医学研究报道，培养的活化HSC能表达α2-巨球蛋白mRNA及合成α2-巨球蛋白，影响MMP活性。但HSC是如何调节自身变化以促进基质沉积及降解双重作用，目前尚无定论。

2  细胞因子对HSC增殖活化的调节与生化指标

    肝纤维化时，HSC在被激活的过程中受到广泛的来源于其它肝细胞（旁分泌）及HSC自身（自分泌）产生的细胞因子的调控。受损肝细胞能产生HSC激活因子，包括IGF（胰岛素样生长因子）及IGF连接蛋白。血小板衍生生长因子（PDGF）是HSC最强大的趋化因子和促分裂原，肝损伤时窦内皮细胞及血小板可产生大量的PDGF，同时激活的HSC亦可产生PDGF。PDGF对HSC活化、分裂、增殖及其合成胶原等均有明显的促进作用；而增殖、活化的HSC表面表达PDGF受体的β异构型，使细胞对PDGF敏感。
库否氏细胞产生的HSC促分裂剂有TNFα、IL-1及TNFα相关蛋白，同时也是TGFβ1的重要来源。此外，转化生长因子α（TGFα）、TGFβ、胰岛素样生长因子1（IGF1）、表皮生长因子（EGF）和HSC刺激因子（LSF）等，主要通过增加HSC对ECM基因表达和翻译和/或刺激HSC增殖和转化起作用。肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素（IL）-1、IL-4、IL-6、IL-8、血小板活化因子（PAF）等，通过促进炎症反应或促进巨噬细胞而影响HSC的增殖和活化。

    转化生长因子β（TGFβ）是肝损伤后全面促进肝纤维化中的一个关键细胞因子，是由HSC和肌成纤维细胞、库否氏细胞及内皮细胞等合成，其中TGFβ1是最主要成分。实验表明TGF-β1以剂量依赖方式刺激Ⅰ、Ⅲ型前胶原合成，TGFβ可上调HSC对Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN、HA的表达，同时可促进静息的HSC向肌成纤维细胞转化，促进ECM的合成。TGFβ不仅能增加ECM的产生，而且能抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的产生，从而抑制ECM的降解。研究还发现，TGFβ还能上调内皮细胞作HSC产生纤溶酶原活化抑制因子（PAI-1）和TIMPs，而这两种物质恰能抑制降解ECM的酶类。TGFβ还能促进其它淋巴细胞合成并分泌细胞因子，如PDGF、EGF等促进纤维细胞增殖因子增多，并从而使肝纤维化一旦启动后可反复持续一个相当阶段。

    总之，在多种损伤因素的刺激下，细胞因子合成和分泌发生变化，通过细胞因子网络分别表现出致纤维化作用和抗纤维化作用，前者的作用加强，后者的作用减弱时，即导致肝纤维化的发生、发展。

3 肝纤维化生化指标的灵敏度问题及对策

    目前应用于临床的生化指标有HA、PCⅢ、LN、CⅣ、PLD、TNFα、TGFβ、IL-1、sICAM-1等，张氏对肝病血清HA、LN、CⅣ联合检测，并与肝组织学结果对照，发现其含量随病情发展而升高，其中HA对早期肝纤维化的诊断优于LN、CⅣ。蔡氏等用B超肝门静脉主干内径、脾门静脉内径及脾厚度和肝穿刺对这四项指标对照观察，发现联合诊断有助于肝纤维化的诊断，HA与肝纤维化程度的符合率最高，其次是CⅣ。杨氏等对肝病患者检测Ⅳ型胶原纤维C末端（Ⅳ-C）、PCⅢ和辅氨酸肽酶（PLD），同时做肝穿组织学检查的病理诊断作为金指标分析，结果发现HA、PCⅢ、PLD对肝纤维化有较高的诊断价值，HA特异性最强。

    在抗肝纤维化的研究中，多方报道结果显示肝纤维化检验生化指标按相关性大小排列依次为HA>PCⅢ>LN>CⅣ，HA最敏感。但临床中也发现肝纤维化生化指标与肝组织学不完全相符的结果，如谢氏对不同年龄患者HA、LN、PCⅢ、CⅣ进行观察发现随年龄增加而略有增加，建议临床应用时要考虑年龄因素。在细胞因子方面，观察发现血清TNFα、TGFβ水平与肝纤维化程度呈正相关，与肝纤维化发生、发展密切相关。TGF-1的活化，TGF-1受体活化后信号由胞质转运至胞核的过程，以及TGF-1活性的调节等，在肝纤维化逆转的过程中起着重要的作用。

    另外还有人提出肝炎后肝硬化患者血清IL-1、TNFα、可溶性细胞间粘附分子-1（sICAM-1）等指标高于正常，认为IL-1、TNFα、sICAM-1的检测对判定肝纤维化严重程度有一定帮助，且sICAM-1与CⅣ、LN呈显著正相关。

    关于降解酶及其抑制物的研究，Lichtinghangen等认为外周血白细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的mRNA水平与血清中蛋白浓度无关，血循环中MMP-2/TIMP-1的比值与肝纤维化程度相关。Boeker等对59例慢性丙型肝炎、19例丙肝肝硬化、30例健康人血清TIMP-1水平的变化研究后发现：正常对照组<慢性肝炎无肝纤维化者<慢性肝炎伴有肝纤维化者<肝硬化者，说明血清TIMP-1对肝纤维化的早期诊断有一定价值。uPA治疗可透导全部肝实质及门脉周围的肝细胞增生，有促进ECM吸收的作用。因此，uPA治疗具有一定的优越性，可能成为肝纤维化治疗的一个新手段。另一方面，通过抑制PAI-1的表达，也可起到增强纤溶酶活性、促进ECM降解的作用。Reroll E等认为，PAI-1将是治疗纤维化的一个潜在靶点。

    随着分子生物学和细胞周期的调控学说的进一步发展，肝纤维化研究已有进一步发展，目前的研究已从ECM生成机制转经到重视ECM降解的研究，作为ECM降解的重要指标，MMP/TIMP、PA/PAI对肝纤维化的调节作用在动物实验研究已经得到证实，但体外模型HSC-L190实验和临床尚无成功的报道。但因其在肝纤维化的生成和逆转机制的重要性，现正为动物实验的研究热点，今后将成为药物抗肝纤维化临床研究的主要参考指标。

    理想的诊断和疗效判定指标应具有高度敏感和特异性，且简便易行，患者易于接受，故寻求无创性诊断肝纤维化的有效方法是目前临床医生关注的问题和热点。因肝纤维化形成有炎症、免疫反应等多种因素，机理复杂，所以单一的指标对病情的诊断和疗效的评定是不全面的，需多种指标联合观察。目前，穿刺肝组织学检查仍作为临床诊断的金标准，但因其实施的范围有限，具有创伤性，容易引起副作用，故非创伤性的联合使用的肝纤维化指标谱仍具有极其重要的价值。

摘自《国外医学》2003年第6期