张雪酶　尹一兵　陈茶　陈保德　孟江萍　康格非

摘要　
目的：探讨肺炎链球菌在对抗β－内酰胺类抗生素时是否受到感受态形成的影响。

方法　通过转化得到感受态缺陷菌株，采用半定量RT－PCR检测相关基因ciaH和cpoA在细菌感受态形成时的表达，用肉汤法检测各菌株的最低的抑菌浓度（MIC）。

结果　细菌感受态时基因ciaH和cpoA的mRNA表达量增高（P<0.05），野生菌感受态缺陷后的MIC值发生改变。

结论　肺炎链球菌的感受态形成可诱导ciaH和cpoA的表达增加，其感受态缺陷影响到其对β-内酰胺类抗生素的敏感性，但不同菌株的影响不同。


    β-内酰胺类抗生物是目前使用广泛的一类抗生素，然而越来越多的细菌对它产生了耐药性，包括肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn），而且有逐年上升的趋势。目前已知的耐药机制主要有两种：一种是细菌产生β-内酰胺酶降解抗生素，使抗生素在到达靶作用点以前就失去活性。另一种就是改变抗生素作用于自身的受体，即青霉素结合蛋白（PBPs）。而对于一些革兰阴性菌，改变细胞膜的通透性，也可以降低其对的抗生素的敏感性。

    肺炎链球菌对青霉素耐药的作用过程包含了PBPs蛋白一系列变异。在一些青霉素耐药的菌株中的PBPs的结构有所改变，与β-酰胺类抗生素的亲和性降低，从而降低了对抗生素的敏感性。人们发现β-酰胺类抗生素对肺炎链球菌的作用有两种方式：一种是以哌拉西林为代表的裂菌式；另一种是以头孢胺噻为代表的作用方式，这些头孢菌素类抗生素杀菌并不溶菌，这表明β-酰胺类抗生素作用于肺炎链球菌存在一些非PBPs无关的作用机制。目前人们已经发现了一些非PBPs的耐药相关基因，但并不清楚它们的作用机制。有趣的是，这些与非PBPs基因相关的肺炎链球菌耐药菌株都是感受态缺陷菌株。提示细菌的感受态可能与非PBPs途径的耐药机理相关。

    感受态是肺炎链球菌在其生长的某一阶段自然形成的一种状态，这时它可以摄取周围裸露的DNA片段。这类似人们熟悉的在实验室制备大肠肝菌的感受态，不同的是大肠杆菌不能自然形成此状态。肺炎链球菌的感受态是由一个叫作感受态刺激因子（competence-stimulating peptide,CSP）的17肽诱导形成的，CSP的下游基因为comDE。comCDE是各种环境因素如：Ca离子浓度、空气中的氧浓度、pH值以及细菌密度等调节感受态的综合调控点。失活其中任何一个基因，细菌就不能形成感受感。我们采用替代复制的手段失活comE得到肺炎链球菌的感受态缺陷菌株。

    最早发现的一个非PBPs的耐药基因是ciaH，一种组氨酸蛋白激酶。人们发现在头孢噻耐药的肺炎链球菌中，有3株感受态缺陷菌株的PBPs没有异常改变，而发现ciaH的基因有变化。转化变异的ciaH到抗生素敏感的肺炎链球菌中，转化细菌同样程度耐药，提示细菌的耐药与ciaH的变异相关。另一研究则发现在哌拉西林耐药菌株中存在另一个基因cpoA的变化，这些菌株同样感受态缺陷。研究发现，与ciaH不同，cpoA的变异体仍有一定的感受态诱导活性，只是在较晚的时候发生。

    与非PBPs相关变异的耐药基因都与细菌的感受态相关，这提示肺炎链球菌的感受态可能影响了它们的表达，但目前的研究都只限于已发现的两种基因ciaH和cpoA对细菌感受态的影响，并没有研究感受态是否影响它们的表达。本研究则希望通过比较野生菌株和其相应感受态缺陷菌株的ciaH和cpoA基因的表达以及它们耐药的情况，探讨肺炎链球菌感受态在耐β-酰胺类抗生素机制中的作用。

材料和方法

    试验菌株：2型光滑型（SⅡ型）肺炎链球菌（1和2号菌株），由中国医学科学院提供，主要遗传特征经鉴定合格：血平板培养呈光滑、半透明、扁平小菌落，并有草绿色溶血环、胆汁溶菌实验阳性、菊糖分解实验阳性及奥普脱星实验阴性。临床分离的肺炎链球菌（22号菌株），由日本鸟取医学院附属医院提供，主要遗传特征经鉴定合格，鉴定结果同上。

    主要试验试剂：C+Y半合成培养基，含0.5%Yeast抽提物（Lacks and Hotchkiss,1960）。肺炎链球菌CP1250的染色体DNA（含有链霉素抗性基因str）、肺炎链球菌（CPM17的染色体DNA（含有标志基因红霉素抗生基因erm的comE断裂基因）、感受态刺激因子（CSP），由美国Morrison教授提供。特异和随机引物，由上海博亚生物技术有限公司合成提供。逆转录酶M-MVL,购于Promega。肺炎链球菌的头孢胺噻和哌拉西林MIC实验培养基，由重庆庞通公司提供，抗生素浓度分别为：0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、2µg/ml。

    肺炎链球菌感受态缺陷菌株的制备及鉴定：将肺炎链球菌培养于CTM培养基（C+Y培养基、1mmol/L的CaCl2和0.2%BSA）中至A550=0.08，加入CSP 20mg/ml，同时加入comE断裂基因（comEup-erm-comEdw）的PCR产物1mg/ml，于37℃孵育90min，然后铺于含红霉素（0.25µg/ml）的血平板（TSA）上，于37℃孵育培养36h，挑取菌落于TSB培养基中，当细菌密度达到A620=0.2时，冻于-70℃冰箱保存，此即为转化菌株。通过转化实验和以comE和erm的引物做PCR鉴定所得菌株。

半定量RT-PCR测定ciaH、cpoA、comE和cinA的表达
    总RNA的提取：将1、2和22号肺炎链球菌及其感受态缺陷菌株1t、2t和22t分别培养于C+Y培养基中（含1mmol/L的CaCl2和0.2%BSA），在A550分别为0.09、0.1、0.07时各加入CSP至20ng/ml，诱导感受态发生。分别在加入CSP的0min、10min、20min3个时相取1ml菌液，冻于-70℃冰箱，用以RNA提取。将所取的样本按Qiagen试剂盒的总RNA提取法提取总RNA。

    半定量RT-PCR：取RNA4µl,随机引物1µl，DEPC水7µl，混匀后，70℃变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录缓冲液5µl,dNTP(2mmol/L)1.5µl，RNasin（30U/µl）0.5µl，DEPC水5µl，逆转录酶M-MLV（100U/µl）1µl。混匀后于37℃1h，得到cDNA。

    以cDNA为模板，以基因16S rRNA（此处为内参）、ciaH、cpoA、comE和cinA（一种感受态诱导基因，此处为发生感受态度的阳性对照）的引物（序列见表1），分别PCR扩增相应片段。循环参数为：94℃1min，55℃40s，72℃45s，30个循环，琼脂糖电泳，照相。

    肺炎链球菌最低抑菌浓度（MIC）的测定：（1）将1、1t、2、2t、22和22t等6株肺炎链球菌接种血平板上，37℃,5% CO2孵箱培养24h。（2）用接种环刮取菌苔，于无菌生理盐水中混匀，于麦氏单位测定以上检测菌浓度，调节到菌浓度为0.5 Mcfarland浊度[（1～2）×108CFU/ml]。（3）将菌液用无菌生理盐水10倍稀释2次，使菌浓度为（1～2）×106CFU/ml。（4）将稀释好的菌液取100µl加入含马血清的不同抗生素浓度肉汤培养基中，37℃,5% CO2孵箱培养24h。（5）各管混匀后，分别取100µl菌液于血平板上培养24h，活菌少于5个的即为药物对该菌株的MIC。

    统计学方法：采用配对t检验，以Quantity-one3.0统计软件对数据进行分析。

结　　果

1.肺炎链球菌感受态缺陷菌株的获得：利用comE断裂基因PCR产物转化1、2和22号菌株分别得到转化菌株1t、2t和22t。转化鉴定表明，1t、2t和22t感受态缺陷菌株没有得到转化菌落（转化率为0）。PCR鉴定表明，缺陷菌株分别在1515bp和726bp处有产物，而野生菌则没有这2个片段的产物。

2.半定量RT-PCR：分别测定各株肺炎链球菌在加入CSP的0min、10min和20min这3个时相时ciaH、cpoA、comE和cinA基因的mRNA表达量，结果见表2和图1、2和3（Marker1：Gene RulerTM1kb DNA Ladder,Marker2: ΦX174DNA/HinfI）。
RT-PCR结果显示在未加入CSP时，野生菌株和感受态缺陷菌株的基因ciaH（396bp）、cpoA（722bp）和comE（野生株1229bp,缺陷菌株1515bp）有一定量的基础表达。在加入CSP后10min时，基因ciaH、cpoA、comE和cinA在各野生菌株中的表达量较未加入CSP（加入CSP后0min）时都有不同程度的增加（P<0.05），只有1号菌株的基因cpoA表达量的增加没有统计学意义（P>0.05）。基因comE和cinA是肺炎链球菌感受态发生后特异诱导表达的基因，本研究以它们为感受态发生的阳性对照。实验结果表明CSP加入后二者表达显著增高，表明细菌感受态被CSP诱导发生。统计学分析则表明在细菌感受态发生的同时，基因ciaH和cpoA的表达也显著增强。

图1　肺炎链球菌1和1t在感受态发生时基因cpoA和ciaH的mRNA表达

3.各株肺炎链球菌的MIC值测定：按照方法中的操作步骤测定各株细菌的MIC值，重复测定2次。实验结果表明（见表3），感受态缺陷菌株对头孢胺噻和哌拉西林的MIC值的确与其野生菌株有差异，但3种菌株的MIC值都较缺陷菌株低，2号菌株的变化正好相反，而22号菌株对头孢胺噻的MIC值较缺陷菌株高，对哌拉西林的MIC值则较之低。

表2　Quantity-one软件分析的各基因表达量与相应16S rRNA表达量的比值

图2　肺炎链球菌2和2t在感受态发生时基因cpoA和ciaH和mRNA

图3　肺炎链球菌22和22t在感受态发生时基因cpoA和ciaH的mRNA表达

讨　　论

    对头孢胺噻和哌拉西林的最低抑菌浓度检测的实验结果表明，野生菌株与其感受态缺陷菌株的MIC值的确有差异。提示感受态缺陷可影响菌株对β-内酰胺类抗生素的敏感性，但对不同菌株的影响结果却不尽相同。目前所知的非PBPs类耐药基因只有ciaH和cpoA基因，而它们都与感受态相关。研究认为ciaH系统控制了细菌脂质转运的水平，因而该系统对胞壁质的合成有一定的调控作用。一些学者认为ciaH的变异可能导致自身的异常激活，从而刺激细菌萜醇的合成，使脂质联结的胞壁质前体水平升高，增加了胞壁质的合成。而β-内酰胺类抗生素可能诱导变异的ciaH活化，产生上述反应，以抵消细胞壁的损伤，使细菌表现出耐药性增高。本研究对ciaH的mRNA表达量测定的结果表明，感受态的形成可诱导其表达增加。照上述观点，这些菌株对头孢胺噻的耐药性较其感受态缺陷菌株强，但本研究的结果显示，2和22号菌株符合这论点，而1号菌株的耐药性变化则与之相反。在发现ciaH与耐药有关的同时，人们也发现ciaH在耐药的6株感受态缺陷肺炎链球菌中只3株中有改变。这些结果提示，细菌在对抗头孢菌素类抗生素的过程中，ciaH基因是其中一个比较关键的作用靶点，但很可能还存在另外的受感受态影响的耐药基因，尚需进一步研究。

    据资料显示，cpoA为糖基转移酶样蛋白。如果它的确有此功能，那么变异的cpoA可能缺乏此功能，不能运输糖基到脂质中，这就得到与ciaH变异一样的效果，使脂质单体水平增高，有利于胞壁质的合成。这一假说提示细菌对抗头孢菌素类抗生素的作用不但有ciaH的作用，还可能有cpoA的作用。而本研究表明1号菌株的cpoA表达在感受态发生时不仅没有明显升高反而有所下降，这可能是其对头孢胺噻的耐药变化反常的原因之一。

    据资料显示，基因cpoA参与细菌对抗哌拉西林类抗生素的耐药过程，可能与激发自溶酶的表达有关。对于哌拉西林的耐药变化，3株菌的变化各不一样。22号菌的感受态缺陷菌株的MIC较野生菌的高，即感受态缺陷后菌株对哌拉西林的敏感性降低。1号菌的cpoA并没有随感受态的形成而表达增加，但其感受态缺陷菌对哌拉西林的MIC值却同样较野生菌的高。2号菌的cpoA随感受态的形成而表达显著增加，但其感受态缺陷后对哌拉西林的敏感性却增高了。本实验结果提示，cpoA在细菌对抗哌拉西林类抗生素的过程中并不是最关键的靶作用点，尚存在其它与细菌感受态相关的基因参与此耐药过程。

摘自《中华微生物学和免疫学杂志》2003年第12期