侯  琦，马筱玲
       安徽省立医院检验科

  尿路感染诊断的依据是临床症状和尿液分析以及相关的检测信息，最后的定论还要取决于尿液培养。细菌培养法耗时，费用相对较高，且阴性率与污染率大大超过培养的阳性率。笔者应用UF-100全自动尿液分析仪，利用流式细胞术的原理，通过检测尿液中的细菌数量，并建立合理的阈值，可以实现对菌尿的标本进行快速、无痛性的筛选，直接预测出尿液培养的结果，从而去除大量的阴性标本，提高了培养检出的阳性率，并且可迅速地提供给临床可靠的检测信息，使病人及时地得到合理地诊治。

    1材料和方法

   1.1 材料

    1.1.1 标本来源：2002年8月至2003年1月间,收集了安徽省立医院的门诊或住院病人的203份(门诊病人标本59份,住院病人标本144份)清洁中段尿标本,其中女性标本130份,男性标本73份。

    1.1.2 仪器及试剂

    1.1.2.1 日本Sysmex公司生产的UF-100全自动尿液分析仪及配套试剂；鞘液、稀释液和染液。

    1.1.2.2 血培养基和无菌尿培养管均由省立医院检验科微生物室自制。

    1.1.2.3 法国梅里埃公司生产的Vitek-32全自动细菌鉴定及分析系统。

    1.1.2.4 Bayer公司生产的CLINITEK-500尿十联干化学分析仪及配套试纸条。     

    1.2 检测程序

    1.2.1 标本的留取：患者晨起第一次尿，用无菌试管收集清洁的中段尿10ml（女性病在留尿前要求清洗外阴）。

    1.2.2 操作步骤：整个检测过程分三个部分：①先用1μl的定量接种环，取待测标本划线接种于血培养基上，35℃培养12～24h，如果是阳性标本，再挑取单个菌落，应用Vitek-32全自动微生物分析仪鉴定菌种；②再用全自动尿液分析仪UF-100对标本进行检测，将标本混匀后，仪器自动吸取800μl的未离心的尿液，自动报告细菌计数结果；③最后用Bayer干化学分析仪检测标本，整个检测过程在2h内完成，以防止尿液中细菌的大量繁殖而不能真实地反应尿液中的细菌数量。操作步骤严格按上述次序执行，防止前面操作对后面过程的污染。 

    1.3 判断方法
    1.3.1 细菌培养的判断标准：以血培养基上的一个菌落计为1000，计算出每1ml尿液的CFU值。判断方法如下：①无菌落生长。②生长菌落计数<104CFU/ml，视为无意义生长。③阳性结果，菌落计数>104CFU/ml。④菌落混合生长超过三种且无优势细菌生长，都视为标本污染。

    1.3.2 分析方法：以细菌培养法为金标准，选择不同的UF-100的细菌计数的阈值，比较两者的相关性，从而可以判断UF-100检测菌尿的可靠性，并寻找出UF-100直接检测出阳性标本的最佳阈值。

   2  结   果

   2.1 不同区段细菌数的阳性率 将UF-100的细菌计数分成7个区段，在每个区段中，将培养法的阳性结果数除以相应的UF-100阳性结果的标本数，以此作为阳性率，比较各个区段培养法检出的阳性率。以UF-100细菌计数的区段为X轴，以阳性率的百分比为Y轴制成图1(略)。

     随着UF-100的细菌计数的结果的增加,培养结果的阳性率也相应增加。当UF-100的细菌计数<1500/μl时，此时培养出的阳性率仅为7.0%，而细菌计数在9000/μl～10500/μl时，培养出的阳性率可达到76.9%，而当细菌计数达到10500/μl以上时，阳性率可达到94.4%。

    2.2 不同范围敏感性和特异性比较　将UF-100所测的细菌计数的结果设置成9个范围，分别计算出这些范围对应的敏感性与特异性以及假阳性率的值（表1）。                  

            表1　UF-100的细菌数不同范围的敏感性与特异性值 

    由表1可以看出，随着细菌数值的不断增大，特异性在逐渐地增大，假阳性率也在减小，但敏感性在逐渐下降。下降到范围设定为≥9000/μl时，特异性达0.98，敏感性下降到0.43，同时，假阳性率为0.02。

  2.3 敏感性与特异性的ROC曲线　以表1中的9个范围对应的假阳性率为X轴，以敏感性为Y轴，绘制成临床诊断的曲线，即ROC曲线（图2）略。

 在曲线图上共有的10个点中，离左上角直线距离最近的点是第5个点，此点对应的范围是细菌数≥6000/μl，即此范围作为检测阈值与培养法比较后，计算出的假阳性率为0.92，敏感性是0.64。由图2可知，在图中所有的10个点中，第5点是敏感性与特异性之和的最大点，这也是评价此方法检测效果最佳的临界值。     

  2.4 最佳阈值与干化学检测方法的比较　将UF-100检测的灵敏度、特异度、假阳性率等的结果与用干化学法检测出的白细胞酯酶（LEU）及亚硝酸盐（NIT）结果进行比较。从上述方法中选择出灵敏度、特异度等多项评价指标均理想的检测方法。以培养法的细菌计数>104CRU/ml作为阳性标准，来计算不同设计方法的敏感性（Sen）、特异性（Sp）、假阳性率（FP）、假阴性率（FN）、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）（见表2）。

  注：a:UF-100的细菌计数≥6000/μl作为阳性阈值。b:UF-100的细菌计数≥1000/μl作为阳性阈值。C：选择出的标本数满足UF-100或者是干化学的阳性标准。d：选择出的标本须同时满足UF-100及干化学的阳性标准。

  从表2中的各组数据中，可知灵敏度最高的是组5，即单纯以细菌计数≥1000/μl来筛选阳性标本的灵敏度可达93.6%，但此方法的特异度仅为32.4%, 同时假阳性率高达67.6%。组1和组7的各项指标结果一致，两组的特异度在7种不同的判断标准中是最高的，达到了95.5%，但这两种方法的灵敏度仅为46.9%。综合分析表2种的各组数据，组3的结果与其它各组比较，灵敏度较高，为63.8%，同时特异度也很好，达到92.4%，且假阳性率较低。

    3   讨   论

  3.1 UF-100细菌数与培养结果相关性分析　UF-100全自动尿液分析仪通过散射、荧光染色以及电阻抗的原理对尿液中的颗粒进行区分鉴定，检测到细菌数值是通过荧光染料对细菌进行染色，然后将收集到的荧光强度和前向散射光的强度经过电脑处理，报告出尿液中存在的细菌数。笔者通过与培养法结果的比较分析，发现两类标本在UF-100上检测出的细菌数量存在显著性差异，阳性标本明显高于阴性标本。从本文图1的统计数据反映出，UF-100的细菌计数值越高，培养法为阳性的机率也就越大。对UF-100报告细菌计数>10000/μl的尿液标本，基上培养的结果也为阳性，反之，当UF-100报告尿液中细菌的数量<1000/μl时，培养的结果基本上也是阴性。

  3.2 最佳阈值的选择　评价菌尿快速诊断实验的效果包括四个重要的因素：①利用该实验进行检测所需的时间；②该实验是否能正确地鉴定出尿液标本中所包含的致病菌的数量即灵敏度；③能够比较可靠地去除大量的阴性标本即阴性预测值；④特异性和阳性预测值是另外两个应该考虑的因素。特异性能够帮助排除真阴性标本，有效地减轻工作量。而阳性预测值则能够确定实验方法对鉴定阳性结果的频率。本文对UF-100的细菌数设定了不同的阈值，通过比较不同阈值的灵敏度、特异性等各项指标来评价诊断的效果。在UF-100检测的细菌数>1000/μl时，此时与金标准对比，判断出结果的特异度较低，假阳性率很高，不能正确地预测出培养结果。如果将UF-100的细菌计数的阳性阈值提高为细菌数≥9000/μl时，此时的特异度也随之提高，但灵敏度也大幅下降。说明UF-100的阳性阈值的增加可以提高诊断的特异性，但会有大量的菌尿标本漏检。本实验通过绘制ROC曲线方法，来寻找出用UF-100检测菌尿的最佳阈值。在图2的10个点上可见，距离左上角最近的点是第5点，根据ROC曲线设计的原理可知，第5点即是一种实验方法诊断最佳的临界点，在本实验中，就是UF-100检测菌尿的最佳阈值。图2上第5点对应的阈值范围是细菌数≥6000/μl，以此阈值作为阳性结果的判断标准，其特异度是92.4%，灵敏度是63.8%，假阳性率是7.6%，假阴性率是36.2%，与其它阈值的特异度和灵敏度比较后，此阈值的综合评价指标最佳。

  3.3 最佳阈值与化学试带等检测方法的比较分析　在表2中，用UF-100的最佳阈值检测标本所计算出的各项指标与干化学试带法结果进行了比较：①虽然亚硝酸盐筛选法的特异性较高，但是此方法不敏感（灵敏度仅为46.9%），仅能检测出含有硝酸盐还原酶的细菌，主要是肠杆菌科细菌，对于病原菌不含有硝酸盐还原酶的细菌则检测不出来。②如果单独用白细胞酯酶来进行判断，该方法的灵敏度和特异度均较低。原因是在尿路感染的早期，细菌仅存在于尿道壁，此时尿液中并不存在白细胞。只有当存在于膀胱中的细菌数非常高时（≥105CFU/ml），白细胞才进入尿液中，在检测时才可能检测到白细胞。③将UF-100的细菌数≥1000/μl结合白细胞酯酶阳性作为判断阳性结果的标本，会出现较多的假阴性结果。④如果将判断的标准设定为UF-100的细菌数≥6000/μl或者是亚硝酸盐阳性，特异度下降的同时假阴性率也增加了，说明此种组合判断出的结果，也存在着较多的假阴性。综合上述分析，可以得出结论，利用UF-100对菌尿进行快速检测时，将判断的阈值设定为细胞数≥6000/μl，可以获得理想的检测结果。

  3.4 UF-100检测结果的误差分析　笔者认为实验的金标准——培养法也存在假阴性结果。本试验所用的培养基是普通的营养培养基，它仅能培养出需氧菌和兼性厌氧菌，而对于厌氧菌和苛养菌，普通的培养基不能培养出来。且培养法的培养时间大多是12～24h，有些细菌的生长高峰期是在24h后，因而在常规的培养时间内有时出现菌落数<104CFU/ml的假阴性结果。此外当病人体内存留有高浓度的抗生素时，杀死了尿液中大量的细菌，此时培养法的结果是阴性，但是尿液中仍然存在着大量死亡细菌。UF-100计数的是尿液中存在的细菌量，包括活细菌和死细菌在内，因此可知，UF-100所检测的这部分“假阳性”结果，有可能是病人在留尿时没有停止抗生素的使用，造成了培养法结果与UF-100的检测结果不吻合的现象，需要进行综合分析后判断。

   综上所述，本实验通过分析后认为，以细菌计数≥6000/μl作为判断菌尿阴阳性结果的指标，与金标准比较可以获得理想的检测结果，由此提高了细菌培养法的针对性。并且对于UF-100检测出的细菌数量<1000/μl的尿液标本，如果病人无相关的临床症状，就无需做尿培养。而对于UF-100检测出的细菌数量>10000/μl的标本，结合病人的临床表现，即使尿培养结果为阴性，也应考虑尿路感染的可能性。

  总而言之，只要设立好合理的阈值，可以应用简便的检测方法实现尿路感染快速而准确的实验室诊断。

摘自《现代检验医学杂志》2003年第6期