王沛

金黄色葡萄球菌(金葡菌)和凝固酶阴性葡萄球菌是血培养中常见的病原菌,传统的微生物鉴定方法需要24h～48h,建立一种简便、灵敏、特异的方法快速鉴定血培养中的金葡萄和凝固酶阴性葡萄球菌显得尤为重要。本研究通过荧光原位杂交技术（FISH），使用标记有不同荧光同位素的寡核苷酸混合探针，在同一张玻片上可同时快速鉴定血培养中的金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌。

材料和方法

一、材料

1．血培养：收集格罗宁大学医学院教学医院自2002年6月～2003年7月的阳性血培养瓶587瓶，其中259瓶为葡萄球菌属。BACT/ALERT报警后，同时使用本法与传统培养法鉴定。

2．参考菌株：所有参考菌株见表2。DSM（德国菌种保存中心），ATCC（美国菌种保存中心），MMB（荷兰格罗宁根大学医学微生物系实验室），所有MMB菌株均经常规方法鉴定。

3.寡核苷酸探针:检测金葡菌的探针Stau72于5′端标记Cy3(红色信号),检测凝固酶阴性葡萄球菌的探针由Stepi65与Sthae228混合而成,于5′端标记FTTC(绿色信号),同时以通用探针Eub338和互补通用探针Non-Eub分别作阳性阴性对照；探针的合成由Euro Gentee BV(Maastricht,荷兰).探针序列见表1。

表1 探针序列

探针	序列（5′→3′	靶细菌
Eub338	CCTGCCTCCCGTAGGAGT	所有细菌
Non-Eub	ACTCCTACGGGAGGCAGC	阴性对照
Stau72	GAAGGAAGGTTCYCGTCCG	金葡菌
Stepi65	AGCTCCTCGTCTGTTCGT	CoNs
Sthae228	TAATACGGCGCGGGTCCA	CoNs

二、方法

荧光原位杂交：荧光原位杂交方法且有所改进。方法：当BACT/ALERT报警后，取阳性血培养液涂片革兰染色，若发现成簇排列的阳性球菌，用注射器抽取15μl阳性血液于干净的玻片上，空气干燥；96%乙醇固定10min，空气干燥；溶菌酶（Sigama公司）2mg/ml 32℃处理10 min，MilliQ纯水洗涤后空气干燥，接着以60U/ml的溶葡萄珠菌素（Sigama公司）32℃处理10min，MilliQ纯水洗涤后空气干燥；两种酶均溶于10mmol/L Tris，pH8.0的缓冲液中。随后将玻片置于70%的乙醇固定2min，空气干燥；加入浓度为10ng/ml的混合探针，探针以10%甲醛杂交缓冲液稀释（20mmol/L Tris-HC1，0.9mol/L NaC1，0.1% SDS,pH7.2），于50℃下杂交1h；置玻片于洗涤缓冲液中（20mmol/LTris-HC1,180mmol/L NaC1，pH7.2）于50℃下洗涤10min，MilliQ纯水洗涤后空气干燥；滴上1滴荧光媒介油荧光显微镜下观察。

结   果

1.杂交条件的优化：（1）大多数的CoNs对溶葡萄球菌素不敏感，但也有少数CoNs对溶葡萄球菌素敏感，所以为了让更多的探针进入细胞内，我们使用了较高浓度的溶葡萄球菌素（60U/ml）。（2理论上不可能设计一条特异检测所有CoNs的探针，我们选择了能靶定不同检测范围的Stepi65和Sthae228混合探针，可以检测95%以上CoNs菌株。（3）由于使用了溶菌处理，溶菌后再以70%的乙醇固定2min，可以减少细胞的丢失。（4）使用10%甲醛杂交缓冲液可提高杂交严谨性，使金葡菌和CoNs达到很好的杂交效果。

2.探针的特异性评价：本研究使用7株金葡菌和9株CoNs菌株，1株链球菌，2株肠球菌评价探针的特异性。理论上Stau72探针可以检测所有的金葡菌，Stepi65探针混合Sthae228探针可以检测95%以上的CoNs菌株。形态学相似的微球菌、链球菌和肠球菌与Stau72探针，Stepi65探针，及Sthae228均无交叉反应，探针检测结果见表2。

表2 探针的特异性评价结果

菌  株	菌株编码	Stau72	Stepi65	Sthae228
金葡菌	ATCC29213	+	-	-
金葡菌	ATCC25923	+	-	-
金葡菌	DSM010550	+	-	-
金葡菌	DSM010583	+	-	-
金葡菌	DSM010768	+	-	-
金葡菌	MMB	+	-	-
金葡菌	DSM0101019	+	-	-
缓慢葡萄球菌	MMB	-	-	+
施氏葡萄球菌	DSM4807	-	-	+
头状葡萄球菌	ATCC35661	-	+	+
溶血葡萄球菌	DSM20264	-	+	+
人葡萄球菌	MMB	-	+	+
本糖葡萄球菌	MMB	-	+	+
沃氏葡萄球菌	MMB	-	-	-
表皮葡萄球菌	ATCC122228E	-	+	-
表皮葡萄球菌	ATCC122228D1	-	+	-
肺炎链球菌	DSM20566	-	-	-
粪肠球菌	ATCC29212	-	-	-
尿肠球菌	ATCC29213	-	-	-
藤黄微球菌	ATCC49732	-	-	-

　　3．两种方法与培养法结果比较：在259份葡萄球菌阳性血培养中，传统法检测出金葡菌80株，CoNs179株；杂交法检测出金葡菌80株，CoNs171株，结果见表3。因此杂交法中金葡菌探针的特异性和敏感性均为100%，CoNs的特异性和敏感性分别为100%和95.5%。

表3 各种菌株应用FISH法检测259份临床标本结果（株）

细 菌	株数	杂交法中的阳性菌株检出数
		Eub338	Non-Eub	Stau72	CoNs
金葡菌	80	80	0	80	0
表皮葡萄球菌	122	122	0	0	118
溶血葡萄球菌	25	25	0	0	25
人葡萄球菌	10	10	0	0	10
府生葡萄球菌	6	6	0	0	6
木糖葡萄球菌	3	3	0	0	3
模仿葡萄球菌	4	4	0	0	4
沃氏葡萄球菌	4	4	0	0	0
其他CoNs	5	5	0	0	5
合计	259	259	0	80	171

4.鉴定时间比较：培养法鉴定时间为48～72h，杂交法鉴定时间为2h。

5．杂交法最低检出限：将模拟阳性菌稀释至10³～10⁶ CFU/ml，最低检出限为10³ CFU/ml。

讨  论

快速、灵敏、特异、简便地鉴定微生物是当今微生物学的发展方向，对血培养标本中细菌鉴定也不例外。事实上，早期鉴定出感染菌是金葡菌或CoNs，能为临床医生提供极有价值的抗生素使用信息，如结合病人的临床资料，也能帮助临床医生判断阳性菌是否为污染菌，减少抗生素的不合理使用，降低住院费用，延缓细菌耐药性的发展。

传统的微生物鉴定方法需要24～48h，远不能满足临床需要。本研究建立的荧光原位杂交法，在同一张玻片上，通过改变滤光片检测红色和绿色的荧光信号鉴定待检菌为金葡菌或CoNs，操作简便。