刘芳、刘仲明、李家洲

广州军区广州总医院医学实验科

 摘 要：为了建立石英晶体DNA传感器检测乙肝病毒基因的方法，在石英晶体表面固定单链DNA，构成压电晶体HBV DNA生物传感器，与待测样品进行杂交反应。结果DNA传感器能准确的诊断血清中的HBV病毒基因。石英晶体HBV DNA生物传感器具有操作省时、简单，能用于临床实验、诊断、检测。

关键词：DNA生物传感器；石英晶体；诊断

   现有的HBV检测，是通过检测HBV产生的5种抗原蛋白来间接检测HBV，也就是通常所说的“两对半”检测法。但有时由于使用药物得到免疫性结果，使抗原不被表达，通过检测抗原的办法来检测HBV就会产生假阴性的结果。另外，当血液中的HBV消失时，有关的抗原并不能立即消失，这样用“两对半”来检测时，又会产生假阳性的问题。为了克服上述缺陷，我们提出用DNA传感器来直接HBV的设想。据此，开发出特异性好、灵敏度高、寿命长、响应时间短、能重复使用检测HBV的DNA传感器是至关重要的。

1　传感器的制备

1.       表面处理

本研究采用的石英晶体传感器，其镀金表面在使用前要经过预处理，以除去表面的有机杂质。处理方法是：取AT切石英晶体，先用超声波清洗5min，再用Piranha溶液浸泡30min，最后依次用纯净水、丙酮、无水乙醇、纯净水清洗。N₂干燥后测定石英晶体的基频F₀。

1．2．DNA探针的固定

1．2．1自组装法固定

自组装法固定DNA的基本原理见图1（略）。

探针固定液是将带有已硫醇标记的DNA探针，用0.3MNaC1 pH7.9溶液溶解为10μg/mL，取0.26mL DNA探针固定液，在DNA固定容器中浸泡预处理过的石英晶体1h，然后用纯净水清洗。最后用氮气干燥系统干燥，测定所用石英晶体的频率F₁，计算出固定所引起的频率改变量 F₀（ F₀=F₁-F₀）。所有制备过程均在室温下进行。

1．2．2生物素膜法固定

生物素膜法固定DNA的基本原理见图2（略）

其固定方法是将预处理过的石英晶体，用0.26mL 1mM3.3-二硫丙酸浸泡金表面30min，然后用纯净水清洗，N₂干燥系统干燥，测定石英晶体频率F₁。再用0.25mL 100mg/mL EDC和5μL 100mg/mL NHS溶液浸泡30min，浸泡后再用纯净水清洗，N₂干燥系统干燥，测定石英晶体频率F₂。然后依次用0.26mL0.2mg/mL抗生素浸泡90min，0.26mL 1mM2-氨基乙醇（pH=8.0）浸泡60min，0.26mL生物素标记过的DNA探针固定液浸泡60min，用纯净水清洗，N₂干燥系统干燥，测定石英晶体频率F₃。所有制备过程均在室温下进行。计算固定引起的石英晶体振荡频率改变量 F₀（ F₀=F₃-F₂）。

2　传感器的应用

2．1样品的处理

血液样品预处理：取回的血液样品先经过离心除去红细胞，离心条件为900转/min，离心5min。然后取上层血清，加入氯仿/苯酚溶液（体积比为血清/溶剂=2/1），静置3min，然后以12000转/min离心5min，除去蛋白，取上层血清作检验血清。

2．1．2将制备好的血清样品在水浴锅中99℃变性处理10min。变性完成后，立即取0.26mL样品，置于杂交容器中，恒温48.3℃，用前面方法所制备的石英晶体DNA传感器进行杂交检测。杂交时间为60min。用正常血清样品作对照实验，比较检测结果。

3　讨论

3．1．1固定量的比较

自组装方法和生物素膜法固定的DNA探针，所引起的石英晶体传感器频率改变量F₀，通过表1进行了对比。

表1 两种固定方法引起频率改变量对比（Hz）

从表1中列举的数字来看，用生物素固定后石英晶体频率的改变量其平均值为166.6Hz；用自组装法固定石英晶体频率的改变量其平均值为135.6Hz。生物素膜法固定的量是自组装法固定量的1.2倍。

3.1.2稳定性比较

稳定性是DNA传感器研制中的一个关键参数。只有石英晶体表面固定的DNA能稳定存在，后继的检测工作才能正常进行。稳定性主要是指固定的DNA在恶劣的环境中会不会脱落，例如在强酸或强碱溶液中。为了了解DNA固定的稳定性，将固定好的DNA传感器用1mM/mL HC1溶液或1mM/mLNaOH溶液浸泡4min，然后用纯净水清洗后，氮气干燥，测定浸泡后的晶体频率，计算出浸泡后引起的频率改变量，得出结果见表2、表3。

表2　1mM/ml HCl溶液浸泡后引起频率改变量对比（Hz）

表3 1mM/mL NaOH溶液浸泡后引起频率改变量对比（Hz）

从上述两个表中可以看出，用自组装法固定的DNA传感器，在浸泡后频率趋于上升，上升量约为20Hz多。这说明经过强酸或强碱处理后，用自组装法固定在石英晶体表面的DNA发生了脱落。用生物素膜法固定的DNA，在经过上述处理后，其频率改变量很小，表明用此法固定的DNA探针稳定性比较好。

3．2血清样品对照检测

3．2．1取样

样品由广州军区广州总医院检验科提供，一种是已被免疫法检测出含有高拷贝数的乙肝病毒，另一种是正常人的血液样品，同样也用免疫法检测，证明不含有乙肝病毒。

3．2．2检测

根据前面所讲的样品处理方法，对样品进行处理，取出不含蛋白的血清，在99℃变性处理，使DNA双链解链成为单链，最后在48.3℃条件下，利用固定有乙肝病毒特异性DNA探针的石英晶体传感器定性杂交检测，记录杂交检测所引起的石英晶体DNA传感器频率的下降值，得结果如表4。

从表4中可以看出，石英晶体DNA传感器可以准确检测出血清样品的乙肝病毒，其频率改变量平均为312.4Hz，变化量很明显，可以用仪器检测出来。

表4　真实样品的检测结果  （Hz）

                              摘自《中国医疗器械杂志》2004年第1期