刘芳、刘仲明、李家洲
广州军区广州总医院医学实验科

摘  要：为了建立石英晶体DNA传感器检测乙肝病毒基因的方法，在石英晶体表面固定单链DNA，构成压电晶体HBV DNA生物传感器，与待测样品进行杂交反应。结果DNA传感器能准确的诊断血清中的HBV病毒基因。石英晶体HBV DNA生物传感器具有操作省时、简单，能用于临床实验、诊断、检测。

关键词：DNA生物传感器；石英晶体；诊断

   现有的HBV检测，是通过检测HBV产生的5种抗原蛋白来间接检测HBV，也就是通常所说的“两对半”检测法。但有时由于使用药物得到免疫性结果，使抗原不被表达，通过检测抗原的办法来检测HBV就会产生假阴性的结果。另外，当血液中的HBV消失时，有关的抗原并不能立即消失，这样用“两对半”来检测时，又会产生假阳性的问题。为了克服上述缺陷，我们提出用DNA传感器来直接HBV的设想。据此，开发出特异性好、灵敏度高、寿命长、响应时间短、能重复使用检测HBV的DNA传感器是至关重要的。

1　传感器的制备

1. 1  表面处理

   本研究采用的石英晶体传感器，其镀金表面在使用前要经过预处理，以除去表面的有机杂质。处理方法是：取AT切石英晶体，先用超声波清洗5min，再用Piranha溶液浸泡30min，最后依次用纯净水、丙酮、无水乙醇、纯净水清洗。N2干燥后测定石英晶体的基频F0。

1．2   DNA探针的固定

1．2．1自组装法固定

  自组装法固定DNA的基本原理见图1（略）。
  探针固定液是将带有已硫醇标记的DNA探针，用0.3MNaC1 pH7.9溶液溶解为10μg/mL，取0.26mL DNA探针固定液，在DNA固定容器中浸泡预处理过的石英晶体1h，然后用纯净水清洗。最后用氮气干燥系统干燥，测定所用石英晶体的频率F1，计算出固定所引起的频率改变量 F0（ F0=F1-F0）。所有制备过程均在室温下进行。

1．2．2   生物素膜法固定

   生物素膜法固定DNA的基本原理见图2（略）
   其固定方法是将预处理过的石英晶体，用0.26mL 1mM3.3-二硫丙酸浸泡金表面30min，然后用纯净水清洗，N2干燥系统干燥，测定石英晶体频率F1。再用0.25mL 100mg/mL EDC和5μL 100mg/mL NHS溶液浸泡30min，浸泡后再用纯净水清洗，N2干燥系统干燥，测定石英晶体频率F2。然后依次用0.26mL0.2mg/mL抗生素浸泡90min，0.26mL 1mM2-氨基乙醇（pH=8.0）浸泡60min，0.26mL生物素标记过的DNA探针固定液浸泡60min，用纯净水清洗，N2干燥系统干燥，测定石英晶体频率F3。所有制备过程均在室温下进行。计算固定引起的石英晶体振荡频率改变量 F0（ F0=F3-F2）。

2　传感器的应用

2．1   样品的处理

  血液样品预处理：取回的血液样品先经过离心除去红细胞，离心条件为900转/min，离心5min。然后取上层血清，加入氯仿/苯酚溶液（体积比为血清/溶剂=2/1），静置3min，然后以12000转/min离心5min，除去蛋白，取上层血清作检验血清。

2．1．2   将制备好的血清样品在水浴锅中99℃变性处理10min。变性完成后，立即取0.26mL样品，置于杂交容器中，恒温48.3℃，用前面方法所制备的石英晶体DNA传感器进行杂交检测。杂交时间为60min。用正常血清样品作对照实验，比较检测结果。

3　讨论

3．1．1  固定量的比较

   自组装方法和生物素膜法固定的DNA探针，所引起的石英晶体传感器频率改变量 F0，通过表1进行了对比。

表1  两种固定方法引起频率改变量对比（Hz）