邱国强，吴浩清，谢晓宝
常州市第一人民医院血液学实验室

    网织血小板（reticulated platelet, R P）与网织红细胞一样都是刚从骨髓中释放出来的未成熟细胞，RP与正常血小板相比胞浆内含有少量mRNA，体积较大，而且有更强的活性。随着血小板的成熟，胞浆内mRNA逐渐消失，体积逐渐变小。RP可以比较精确地反映骨髓血小板生成情况。荧光染料噻唑橙（Thiazole Orange, TO）可以直接穿过活细胞膜进入胞浆，当它与DNA或RNA结合后，其发射荧光强度的能力可增大3000倍。我们建立了流式细胞仪检测RP的方法，检测了健康人和特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura ,ITP）初治患者外周血RP，现将结果报道如下。

1　材料和方法

 1.1 试剂 网织红细胞TO试剂（美国BD公司），由于使用的TO试剂的浓度和孵育时间及设定的Mark（阴阳性的界线）的不同，对检测的结果有很大的影响，故对TO试剂进行了一系列不同浓度的稀释，并进行了检测标本的比较，以确定TO试剂的测定浓度。

  1.2 仪器  FACS Calibure流式细胞仪（BD公司）

  1.3 标本及检测方法　21例临床诊断为ITP的初治患者和20例健康献血者的新鲜EDTA抗凝全血5 ml，800r/min离心5min，取出上层富含血小板血浆，用PBS洗涤3次，每次3000r/min离心10min，用含50g/L牛血清白蛋白的PBS制成血小板悬浮液，血小板浓度约100×109/L。检测RP的TO试剂的浓度用缓冲液以4∶6稀释（4份TO试剂加6份缓冲液），50μl的血小板悬液加1ml的TO度剂，室温避光保存1h，上流式细胞仪检测。对照管为50μl的血小板悬液加1ml的缓冲液，以对照管设定Mark检测标本，每份标本收集10万点。

2   结    果

  2.1 TO试剂浓度选择 将TO试剂与缓冲液作8∶2、6∶4、4∶6、2∶8的稀释，检测10例健康人血小板，比较后发现浓度为4∶6时结果满意，浓度为8∶2、6∶4检测结果中的阴性区域整体移向阳性区域，界限不清；而浓度2∶8者检测结果与阴性对照基本无区别。4∶6浓度的TO试剂的阴性区域与阴性对照一致，阳性区域则有网织血小板，区别明显。

 2.2 标本检测结果　以4∶6浓度的TO试剂检测了21例ITP初治患者（血小板计数均<5万）和20例健康人（血小板计数均>12万）外周血RP。ITP初治患者的RP为（35.22±10.52）%，健康人RP为（5.13±1.51）%，两组相比有显著的差异（t=12.968，P<0.01）。ITP患者经治疗恢复后RP为（7.03±1.38）%，较前显著降低，但与正常对照组相比仍有显著的差异（t=4.199，P<0.01）。

3  讨    论

   由于RP是刚从骨髓释放出来的未成熟血小板，它可以象检测网织红细胞反映骨髓红系的造血情况一样，用来鉴别血小板减少性疾病和监测治疗后的骨髓造血情况。研究发现ITP初治患者RP分比比正常对照组明显升高，治疗后，外周血小板计数逐渐恢复，RP也逐渐恢复，因此可用来对治疗效果进行监测。绝大多数研究都采用了TO染色的流式细胞仪检测法，但是所报道的RP参考值却存在着较大的差异。Kienast等报道的参考值为（8.6±2.8）%，Rinder等报道（2.9±2.2）%，Bonan等报道男性正常参考值为（3.64±2.10）%，女性正常参考值（5.79±2.22）%，并认为男女正常参考值差异与女性月经有关。RP参考值的较大差异是因为对RP的检测还没有规范的检测方法和参考标准，如样品的准备，样品与TO孵育的时间、温度，TO的使用浓度等。目前国际专家小组正在努力使RP的检测方法进一步标准化。在这之前，各个实验室应该建立自己的正常参考值，以达到对临床的辅助诊断作用。本研究的结果表明采用流式细胞仪检测网织血小板可作为判断血小板增生的客观指标。

摘自《临床检验杂志》2004年第2期