岳志红 张正

   近年来，有关端粒和端粒酶的研究异常活跃。随端粒酶结构、功能及调控的深入研究，人们对端粒酶在细胞永生化及癌变中的作用有了新的认识。端粒酶检测技术对恶性肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗监测具有重要的临床意义。

一、端粒酶检测技术

（一）研究进展

端粒是真核细胞染色体末端的一个特殊结构，由一段具有特定重复的DNA序列和端粒结合蛋白组成，是维持染色体结构稳定的重要因素。端粒酶是一种核糖核酸蛋白酶，能够利用自身RNA为模板合成端粒DNA，使端粒延伸并维持其稳定。端粒酶功能行使最低限度需要两个部分，RNA组成和催化亚单位。RNA组分（human telomerase RNA，hTR）为端粒酶合成端粒重复序列提供了模板，催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）含有保守的逆转录酶模体。

人体正常细胞的生长和发育受到端粒酶活性严格调控。绝大多数正常体细胞无端粒酶活性表达，随着细胞分裂的进行，端粒逐渐缩短，决定了细胞分裂次数和细胞寿命，但在部分血液细胞、上皮细胞及生殖细胞中有低活性的端粒酶表达。在正常的人体中，端粒的程序性缩短限制了转化细胞的生长能力，这很可能是肿瘤形成的一个抑制机制。端粒酶的重新表达在肿瘤细胞逃避衰老的过程中起着重要的作用，它的激活可稳定端粒长度甚至使细胞获得永生，其活性与恶性肿瘤的发生密切相关。至今为止，将近90%恶性肿瘤细胞和永生化细胞有端粒酶活性表达，而且许多肿瘤细胞的端粒酶活性远高于那些高度增殖的正常细胞，甚至在一些肿瘤中端粒酶活性高低与恶性程度一致。因此，端粒酶是目前已知的最通用的肿瘤分子标志生物之一，已成为一个新的肿瘤基因诊断指标。

端粒酶的特殊性使端粒酶检测技术在研究中显得尤为重要。端粒酶活性的检测方法是根据其对端粒精确、特殊的合成机制，通过测定细胞提取物将端粒重复序列添加到一个合成的寡核苷酸引物3′末端的能力进行的。传统的端粒重复序列延伸法，是利用端粒合成时每合成6个核苷酸就会有暂时停顿的原理，用特异的探针标记，聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影。如端粒酶阳性，就会出现特异的梯状条带，每条带间隔6个核苷酸。1994年Kim等建立的端粒重复扩增法（telomere repeat amplification protocol，TRAP）是端粒酶检测的一个重要里程碑。总的来说，端粒酶活性检测方法主要分为TRAP法和非TRAP法两类。每种检测方法均包括端粒酶合成反应和产物检测两个步骤，TRAP法增加了PCR扩增反应。前者产物为双链DNA，后者则为单链DNA。

(二)端粒酶活性检测技术

目前，研究端粒酶活性定量检测方法是为了减少繁锁费时的PCR后检测步骤，改进循环条件来提高敏感性和线性。杂交技术和传统电泳技术相比有许多优点，简单、快速、敏感、定量、适合测定大规模临床标本；无放射污染，减少由污染造成的假阳性反应。将TRAP和各种杂交技术结合起来，使用液相技术和常用临床实验设备，可定量测定端粒酶活性。如将TRAP和接近闪烁分析法（scintillation proximity assay，SPA）结合起来，或利用杂交保护技术（hybridization protection assay，HPA）使用AE(acridinium ester)标记的探针检测端粒酶反应产物。亦有学者利用端粒酶每合成6个碱基端粒酶重复序列同时就有6个焦磷酸释放出来，建立了一种新的检测方法ELIPA（enzymatic luminometric PPi assay）。目前常见方法有以下几种。

1．TRAP-ELISA法测定中，微量酶标板用链霉亲和素包被，能与生物素标记的TS引物结合，将后者固定在板上。PCR反应体系中加入地高辛标记的CX引物，或者采用地高辛标记的TTAGGG特异的探针与端粒酶扩增产物杂交，可用酶标仪测定结果。有研究比较TRAPeze和PCR-ELISA两种试剂盒，显示后者较少受样本细胞数，混杂细胞和抑制物影响。

2．定量杂交技术（quantitative hybridization assay with luminometric detection）：影响端粒酶活性检测的主要因素是由于PCR抑制物存在，导致样本间PCR效率不同，而出现假阴性结果。定量杂交技术在PCR反应体系中引入竞争性的DNA内对照DNA-IS，和端粒酶产物大小接近并具有相同引物识别位点，而仅有18hp序列差异。因此，样本和DNA-IS的比值反映了起始混合物的浓度比值。此方法具有高度特异性，能够识别假阴性结果。和传统电泳、ELISA方法相比，敏感性更好，适用于大规模临床标本检测。

3．RTQ-TRAP（real-time quantitative TRAP）：传统TRAP和其他传统PCR方法一样，也存在不少问题，如动力学范围有限和终点检测PCR产物使精确测定端粒酶活性很困难。有学者利用敏感性荧光染料PicoGreen能特异地与扩增产物双链DNA结合起来，再以荧光光度计检测（激发波长480nm，发射波长520nm），每个样本的DNA浓度则根据对照DNA稀释后制作的标准曲线来计算。而RTQ-TRAP采用荧光染料SYBR Green，在PCR反应过程中和扩增产物双链DNA特异结合，产生荧光信号。可根据每一次循环延伸步骤时密封测试管内反应物产生的荧光信号强度实时检测PCR产物数量。RTQ-TRAP主要优点为：在扩增早期检测PCR产物，此时有足够的反应成分，尚未出现PCR产物累积的抑制作用，保证了端粒酶活性的精确定量，避免了传统TRAP方法终点测定的可能变异。实时密封技术使PCR扩增和测定同时完成，避免了PCR后步骤，使端粒酶检测的线性和敏感性可达一个细胞的水平。使端粒酶测定更快、更简便、更适于大规模样本分析。

端粒酶活性的检测，不仅要求细胞表达端粒酶的所有成分，而且它们必须被正确组装成一个有功能的单位，能够在端粒末端添加重复序列，所以获得有活性细胞是TRAP方法的基本要求。TRAP法测定端粒酶活性也存在假阳性和假阴性问题，假阳性多由表达端粒酶的正常细胞（尤其是外周血淋巴细胞浸润）引起，假阴性与组织提取液中存在PCR抑制物及冷冻标本导致端粒酶降解有关。样本中丰在蛋白活性抑制物，蛋白酶或RNase对于细胞端粒酶活性均为不稳定的因素，影响端粒酶检测稳定性，降低敏感性，出现假阴性。TRAP是现今最敏感方法，在端粒酶表达较低情况下，则必须提高加入蛋白提取物的量。反应体系中高浓度蛋白抑制Taq，该方法不能有效用于检测低水平端粒酶表达。

4．非TRAP法：非TRAP法端粒酶延伸产物不经PCR放大，避免了PCR方法产生的问题，但不如TRAP法敏感。有学者使用生物素标记引物延伸，链霉素包被的磁珠或96孔板分离端粒酶反应产物，以此提高敏感性。为了解决抑制物问题，亦有学者采用非PCR为基础的转录介导扩增（transcription-meditated amplification, TMA）技术。TMA采用恒温放大原理，不需要温度循环。采用2种引物（始动引物、反向引物）和2种酶（T7TRNA）聚合酶、逆转录酶）。这种方法快速简便，线性良好，不需专用扩增仪，较少受到抑制物的影响，更适用于临床开展。而且TMA放大的是RNA，在实验室不如DNA稳定，可减少交叉污染导致假阳性。

随着生物芯片技术的进展，利用光纤生物芯片技术和表面薄膜共振（surface plasmon resonance，SPR）的生物芯片技术直接测定端粒酶活性已有报道。快速简便，但价格昂贵。

（三）hTERT-mRNA表达检测

随着人类端粒酶各种组成基因克隆，已证明只有hTERT-mRNA的表达与端粒酶活性密切相关。通过检测其表达，可用于寻找与端粒酶活性平行的新的肿瘤特异性标志物。

有学者利用TaqMan荧光检测系统建立了实时定量RT-PCR检测端粒酶相关基因表达。TaqMan探针与靶基因特异杂交，可实时检测到序列特异性的放大信号。PCR指数扩增早期即可选择信号，精确定量原始RNA模板数量。RTQ-PCR定量检测hTERT-mRNA表达仅需144个碱基片断，不易受抑制物影响。

TRAP以蛋白含量作为定量标准，并非精确定量细胞数的标志物。RT-PCR在检测中也存在定量不准的问题。由于GAPDH、β-actin等看家基因在发生肿瘤时上调；rRNA含量丰富且比大多数mRNA稳定，降解时rRNA并不反映低拷贝数目的hTERT-mRNA，因此即使是以看家基因mRNA或rRNA作为内对照，标准加入量，在某些标本造成了低水平的hTERT，而非细胞低水平的表达。另外，hTERT的转录至少存在六种剪切点，目前定量RT-PCR检测的是基因全部剪接形式，造成有功能活性的hTERT表达测量值偏高。

（四）原位杂交技术

传统TRAP和RT-PCR均是一种液相技术，但无法得知端粒酶活性是来源于样本中肿瘤细胞还是其他细胞。而原位技术使用荧光染料和显微镜可见细胞核中的端粒酶活性和hTERT-mRNA表达。将TRAP法用于原位杂交技术检测单个细胞端粒酶活性，但仅限于新鲜可用细胞。最近，免疫组化技术检测肿瘤组织中hTERT-mRNA估计端粒酶活性。尽管hTERT含量非常低，使用单克隆抗体仍可检测到细胞hTERT-mRNA，甚至可用于石蜡包埋标本。

二、端粒酶与肿瘤诊断

（一）早期诊断

大多数线织是由复杂多样、异质的细胞组成。正常子宫内膜表达端粒酶活性，子宫内膜增生和癌变时，上皮细胞会增多。精确定量端粒酶活性或其它分子标志物将会受到检测标本中细胞组成的影响。以上因素限制了根据组织标本中端粒酶活性或hTERT水平推断单个细胞的含量。在组织水平，子宫内膜癌端粒酶活性和hTERT水平显著高于月经周期或更年期子宫内膜，且增生期高于分泌期和萎缩期。定量测定端粒酶活性和hTERT水平仍可作为绝经前后子宫内膜癌的诊断指标。使用原位杂交技术检测胃癌和癌前组织的hTERT-mRNA表达发现端粒酶表达是胃癌癌变的关键步骤，可作为早期癌症诊断指标。

（二）肿瘤分化程度

对于那些形态学上良恶性难以鉴别的肿瘤，端粒酶是判断肿瘤恶性程度有用的指标。端粒酶活性高低与肿瘤分化程度具有相关性。肺癌患者痰液、支气管灌洗液和活检标本端粒酶活性的对比研究显示，端粒酶活性不仅与患者年龄，而且与肿瘤分期相关。在对胃肠道基质瘤测定中发现，恶性胃肠道基质瘤端粒酶活性明显高于良性胃肠道基质瘤。CML急变期端粒酶活性高于慢性期，且病情进展较快，生存期较短。

（三）预后判断

某些肿瘤组织端粒酶活性随着肿瘤进展而不上调，端粒酶检测与患者的预后有关。端粒长度和端粒酶活性可预测多发性骨髓瘤疾病异质性和生存期。

hTERT-mRNA与端粒酶活性显著相关，但有研究显示hTERT-mRNA表达与预后无关；Wilms肿瘤相反，只有高hTERT-mRNA水平与肿瘤复发相关，而端粒酶表达与预后无关。hTERT表达可作为NSCLC的诊断和预后指标，与肿瘤病理分期和Ki-67表达显著相关。还有研究证实尽管hTERT总的水平与预后无关，但其全长hTERT剪接形式水平和肿瘤病理期一样，可作为独立的预后预测指标。

（四）治疗监测

乳腺癌端粒酶的活性与肿瘤大小、是否有淋巴结转移有关，而与临床症状无关。而且在化疗后端粒酶活性呈快速下降。比较确诊和随访的急性和慢性白血病患者端粒酶活性发现，开始治疗后端粒酶活性下降。高水平hTERT-mRNA水平可作为卵巢癌对铂治疗敏感的指标。

三、存在问题与展望

端粒酶的检测和肿瘤临床病理分期、组织学分型或细胞分化程度一样，可作为一个独立的恶性肿瘤早期诊断、治疗监测和预后判断的指标。

但并非所有的肿瘤标本都可检测到端粒酶，有些类型或阶段肿瘤并无端粒酶活性表达，可能原因有：①肿瘤前体细胞端粒长度未到激活端粒酶的程度或处于静止期，端粒酶活性下调。②样本中存在抑制物或RNase干扰测定。③细胞通过基因重组延长端粒。④端粒酶活性检测限制于表达端粒酶活性细胞的数量。⑤端粒酶活性低于实验分析所有检测的水平。

虽然端粒酶在肿瘤组织中检出率很高，某些良性病变也能检测到端粒酶活性，说明端粒酶活性是细胞增殖的生物学指标，并非恶性变标志。因此，单独用端粒酶诊断恶性肿瘤时要慎重，应考虑到假阳性或假阴性的可能，以免发生误导。

摘自《中华检验医学杂志》2004年第7期