耿红莲  屠小卿  朱烨  陈军  顾鹏飞  范列英  仲人前

【摘要】

目的　探讨血清中抗氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）抗体、抗β2糖蛋白I（β2GPI）抗体及抗内皮细胞抗体（AECA）3种自身抗体与动脉粥样硬化的关系。

方法  分别用酶联免疫吸附法（ELISA）和间接免疫荧光法（IIF）检测118例冠状动脉硬化性心脏病患者及44名健康对照者血清中3种自身抗体水平。

结果　冠心病组血清抗ox-LDL抗体阳性率为32.20%，明显高于健康对照组阳性率6.82%(P=0.001);抗β2GPI抗体阳性率为31.36%，其健康对照组阳性率为11.36%（P=0.009）；血清抗内皮细胞抗体阳性率冠心病组为38.14%，健康对照组为13.64%（P=0.002）。在血脂正常的冠心病组中抗ox-LDL和抗β2GPI抗体阳性率也高于健康对照组。

结论　血清中上述3种自身抗体阳性率与动脉粥样硬化密切相关，抗ox-LDL和抗β2GPI抗体阳性率与血脂无明显相关性，自身免疫反应是动脉粥样硬化的一种可能的发病机制。

【关键词】冠状动脉硬化；自身抗体
         Detection of the positive rates of serum autoantibodies associated with atherosclerosis and its clinical significance   GENG Hong-lian, TU Xiao-qing, ZHU Ye, CHEN Jun,GU Peng-fei,FAN Lie-ying,ZHONG Ren-qian.Department of  Laboratory Diagnosis,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,China
Corresponding author:ZHONG Ren-qian
【Abstract】  Objectives  To explore the relationship between the positive rates of serum anti-ox-LDL、anti-β2GPI、anti-endothelial cell autoantibodies(AECA)and atherosclerosis.Methods The levels of serum anti-ox-LDL and anti-β2GPI antibodies were measured by ELISA.The serum AECA was assayed by indirect immunofluorescence(IIF) in 118 patients with coronary arteriosclerosis disease(CAD)and 44 controls without CAD.Results The positive rates of serum anti-ox-LDL、anti-β2GPI and AECA in CAD group were significantly higher than that in control. (30.20% versus 6.82%,P=0.001;31.36% versus 11.36%,P=0.009;38.14% versus 13.64%,P=0.002,respectively);In addition,the positive rates of serum anti-oxLDL and anti-β2GPI were higher in CAD patients with normal level of plasma lipids than that in control.Conclusions  The positive rates of serum anti-oxLDL、anti-β2GPI and AECA are related to atherosclerosis.Autoimmune reaction might play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis.
【Key words】Coronary arterisclerosis;Autoantibodies
       动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）及其引起的心绞痛、心肌梗死和脑梗死等疾病严重危害人类健康，其发病率和死亡率居高不下，主要是因为该病的病原学和发病机制尚未阐明，因而缺乏早期实验室诊断指标和有效的治疗手段。近年来有研究认为自身免疫应答参与As的发生发展，并有相关报道证实：（1）在试验动物及人类动脉粥样硬化病灶处检测到氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）、β2糖蛋白（β2-glycoprotein I、β2GPI）等自身抗原。（2）患者血清中抗ox-LDL、β2GPI的自身抗体滴度与As发生发展密切相关。（3）动物试验表明，用上述自身抗原来免疫动物，会影响As进展。我们主要探讨血清中抗-ox-LDL、β2GPI自身抗体和抗内皮细胞抗体（AECA）阳性率与冠状动脉硬化性心脏病（CAD）的相关性，进一步了解自身免疫反应在动脉粥样硬化发病中的作用。
对象和方法
1.对象：CAD组：2002年4月～11月本院心内科住院病人，共入选118例经临床诊断为CAD的患者，其诊断根据典型的临床表现、心肮酶学、心电图、并有61例经冠状动脉造影证实。其中男82例，女36例，平均年龄（65±9）岁。正常对照组：共入选44名健康体验者，无既往冠心病史，血脂、肝肾功能均正常，无其他自身免疫性疾病表现，其中男28例，女16例，平均年龄（59±7）岁。以上入选者均空腹采集静脉血，离心后取血清，-20℃冻存备用。
2.抗ox-LDL抗体的检测：抗ox-LDL抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自奥地利Biomedica公司，采用ELISA测定，酶标板包被的ox-LDL为Cu2+氧化LDL所得。操作严格按照说明书进行，血清起始稀释度为1∶50，每个测定板均同时测定6个标准品，其抗体含量依次为37、75、150、300、600、1200mU/ml，根据标准品的吸光度（A）值做出1条标准曲线，可将待测血清A值换算成含量值。
3.抗β2GPI抗体检测：抗β2-GPI抗体ELISA检测试剂盒购自英国Genesis公司，采用ELISA测定，酶标板包被有β2糖蛋白I。6个标准品抗体含量依次为0、5、10、25、50、100U/ml。血清起始稀释度过1∶50，加终止液后，450/620nm波长处酶标仪测A值，据标准曲线换算成含量值。
4.抗内皮细胞抗体检测：间接免疫荧光法检测抗内皮抗体的试剂盒购自德国Euroimmun公司（Genesis,Cambnid-eshire,UK），抗原基质为人脐静脉内皮细胞和灵长类肺组织，第二抗体为FITC标记的抗人IgG抗体。血清起始稀释度为1∶10，甘油封片后，荧光显微镜镜检。阳性血清在人脐静脉内皮细胞中表现为细胞浆的颗粒型荧光，在肺组织切片中表现为血管内皮的特征性荧光。
5.血脂的测定：采用BECKMAN CX4全自动生化分析仪，试剂为日本和光公司产品。按生化常规测定入选患者血脂水平，包括酶法测定总胆固醇（Tc）、甘油三脂（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），抗体阻碍法测定高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），免疫比浊法测定脂蛋白（a）。
6.统计学分析：对照组抗ox-LDL抗体和抗β2GPI抗体含量以 ±s表示，CAD组大于对照组 ±2s为阳性，3种自身抗体测定结果均用阳性率表示。采用t检验方法，运用SPSS10.0软件进行统计分析。
结　　 果
        1.3种自身抗体检测结果：对照组抗ox-LDL抗体水平（197.15±61.67）U/L，CAD组以大于320.48U/L为阳性；抗β2GPI抗体以大于5.26U/ml为阳性；AECA以人脐静脉内皮细胞细胞质的颗粒型荧光为阳性判断标准。3种自身抗体检测结果如表1所示。由表1可以看出CAD组3种自身抗体阳性率均高于对照组，自身抗体阳性率均高于对照组，其差异有显著意义（P<0.01）；3种自身抗体特异性均较高而灵敏度一般；SPSS10.0软件进行两样本率的比较分析发现，CAD组男性与女性之间3种自身抗体阳性率差异无显著意义（P>0.05）。
       2.血脂检测结果；118例CAD患者血脂检测结果，包括总胆固醇、甘油三酯、HDL-C、LDL-C和脂蛋白（a）等项目，均在正常参考值范围内的即为CAD血脂正常者，共有32例；上述指标有任何一项超出正常参考值范围者，即为CAD血脂异常组。健康对照组血脂均为正常。表2对CAD血脂正常组与对照组3种自身抗体的阳性率进行了比较。结果显示，抗ox-LDL抗体和抗β2GPI抗体在CAD血脂正常组阳性率仍高于对照组，其差异有显著意义（P<0.05），AECA阳性率在两组之间的差异无显著意义（P>0.05）。

表1 3种自身抗体在CAD组和对照组的检测结果

注Se：灵敏度；Sp特异性；PV+：阳性预测值；PV-：阴性预测值

表2 CAD血脂正常组与对照组

 讨　　 论

本研究主要探讨了抗ox-LDL、抗β₂GPI和AECA3种自身抗体与CAD的关系。试验结果表明这3种抗体在CAD组阳性率均显著高于对照组（P<0.05），且CAD血脂正常组抗ox-LDL和抗β₂GPI抗体阳性率仍高于对照组（P<0.05），而在CAD组男女性之间抗体阳性率差异无显著意义（P>0.05）。结果提示CAD患者血清中确实有自身抗体水平升高，且其阳性率不依赖于血脂的高低。统计分析提示，虽然3种自身抗体的灵敏度不算高，但其特异性均较高，CAD患者血清中上述自身抗体的检测，有可能作为动脉样硬化症的辅助诊断指标。

动脉粥样硬化是多因素所致疾病，以前认为的吸烟、高血压、高血脂、糖尿病等危险因子已不足以解释As的发生发展。近年来国外有研究认为自身免疫因素与As的发病相关，并有相关自身抗体的研究报道，本研究所检测的抗ox-LDL、抗β₂GPI和AECA是其中备受关注的几种自身抗体。LDL在体内经氧化修饰成为ox-LDL，形成特异性氧化表位，具有很强的免疫原性，能刺激体内免疫系统产生抗ox-LDL的自身抗体，以IgG和IgM型最为常见。George等收集整理了一些经血管造影证实为冠心病患者的数据资料，包括传统危险因子、感染相关性、免疫和自身免疫等方面，并在此基础上建立了一个统计学模型。发现除了25个不同的检测参数外（包括传统危险因子如高血压、高脂血症和糖尿病等），预测冠状动脉粥样硬化涉及范围最好的指标是抗ox-LDL抗体滴度。本研究结果显示，在与As相关的3种自身抗体中，抗ox-LDL抗体的特异性（93.18%）是最高的。β₂GPI在人类动脉粥样斑块的内皮下层大量表达，在体外，内皮细胞与抗β₂GPI抗体共同培养，可使内皮细胞表达黏附分子增加，包括E-选择素，VACM-1和ICAM-1等。β₂GPI介导的体液免疫反应能够激活内皮细胞，刺激其自身黏附分子表达，吸引白细胞浸润，引起局部免疫炎症反应，造成血管内皮损伤，在As形成早期起重要作用。

β₂GPI特异性CD₄⁺T淋巴细胞分泌的IL-6作为一种B细胞活化因子，能够促进抗β₂GPI抗体的产生。本研究表明抗β₂GPI抗体在CAD组阳性率（31.36%）显著高于对照组（11.31%,P=0.009）。AECA可与血管内皮细胞（EC）结合，改变EC的功能，或通过补体依赖及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用破坏EC，加重As患者血管的损伤。国外报道和本研究均证实CAD患者血清中抗ox-LDL、抗β₂GPI和AECA 3种自身抗体阳性率显著高于对照组，自身免疫应答致动脉粥样硬化的作用不容忽视，免疫调节在As防治中的作用也越来越受到人们的关注。但是这些自身抗体的出现，究竟是促进还是抑制As的发展？或者仅仅是自身抗原存在的一种附带反应？这些自身抗体的检测能否作为As辅助诊断和判断预后的指标？这些尚争定论的问题仍需进一步研究探索。

                                          摘自《中华检验医学杂志》2004年第2期