谭岩、方艳秋、段秀梅、刘立华、张雪松、姜艳芳、时阳、刘桂英

    摘要：应用rhIL-18在体外培养系统（coculture system in vitro,CCS）中诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL），探索不同细胞在IL-18起动和促进肿瘤特异性免疫应答方面的作用。采用StemSepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及树突细胞（DC），流式细胞仪分析细胞表型，I-UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性。结果表明，在肿瘤抗原存在的条件下，CCS中rhIL-18能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应；并且，在rhIL-18诱导肿瘤特异性CTL的过程中，rhIL-18、NK细胞、DC及T细胞均起着十分重要的作用，缺少任一组份，均对诱导肿瘤特异性CTL有明显差异（P<0.01）。提示在CCS中，rhIL-18诱导的NK细胞快速杀伤效应及DC的抗原提呈作用，在肿瘤特异性CTL产生过程中，均起着决定性的作用。
    关键词：体外培养系统；rhIL-18；肿瘤杀伤效应；肿瘤特异性CTL

    IL-18能够促进T细胞、NK细胞增殖，刺激T细胞及NK细胞分泌IFN-γ，增强穿孔素及FasL介导的细胞毒作用，并能将NK细胞、吞噬细胞介导的非特异性免疫与Th、Tc细胞介导的特异性免疫有机地结合起来，从而在增强免疫、抗肿瘤、抗感染等方面发挥重要作用。本实验探索应用rhIL-18和外周血纯化的NK细胞、DC、naïve T细胞结合的培养系统（其中NK细胞为16.5%、T细胞为82.7%、DC为0.8%），诱导肿瘤特异性CTL，并对各细胞亚群在IL-18诱导肿瘤特异性CTL中的作用进行了初步探索。

    1  材料与方法
    1.1  材料
    1.1.1  细胞与细胞株   O型健康献血员外周血细胞（长春市中心血站）；U251人脑质瘤细胞、MCF7人乳腺癌细胞、PC-3M人前列腺腺癌细胞、K562人白血病细胞、Hep G2人肝癌细胞，以上肿瘤细胞株均来自ATCC，由美国Merck公司张昕博士提供，本室培养保存。
    1.1.2  重组细胞因子   rhIL-18（本室制备），rhIL-4、rhIL-12、rhGM-CSF、rhIL-2（美国埃特发公司）。
    1.1.3  细胞分离试剂   人NK细胞富集混合单抗（含CD3、CD4、CD14、CD19、CD66b和glycophorinA），人外周血DC富集混合单抗（含CD3、CD14、CD16、CD19、CD34、CD56、CD66b和glycophorinA），人外周血T细胞富集混合单抗（含CD14、CD16、CD19、CD56和glycophorin A）均购于Stem-Cell Technologies公司。
    1.1.4  流式细胞仪检测用单抗  鼠抗人CD4-PE，鼠抗人CD56-PE，鼠抗人HLA-DR-PerCP，鼠抗人CD3-FITC，鼠抗人CD14-FITC，鼠抗人CD19-FITC，鼠抗人CD56-FITC，鼠抗人CD3-FITC均购于长春博特生物有限公司（DAKEWEI BLOTECH CO，LTD）。
    1.2  方法
    1.2.1  Stem SepTM免疫磁性细胞分离方法   分离人外周血DC、NK细胞及T细胞，并应用流式仪分别分析细胞表型。
    1.2.1.1  制备人外周血单核细胞（PBMC）   取4单位O型健康献血员细胞，经淋巴细胞分离液分离，收集PBMC，加入90%FCS及10%DMSO，液氮冻存备用。
    1.2.1.2  分离DC    取含6×108PBMC悬液9ml含1mmol/L  EDTA无钙镁PBS），加入anti-CD32单抗封闭液0.4ml，37℃ 5% CO2培养10min，再加入StemSepTM人DC富集混合抗体磁珠1ml，充分混合，37℃ 5% CO2培养30min，过无菌磁性筛柱，收集未标记的目的细胞，PBS洗涤3次。取1×105个细胞，用荧光抗体标记、流式细胞仪分析细胞表型，剩余细胞加入含10ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4的10% FCS的IMDM培养液培养，实验前加入培养系统（细胞比例为0.8%）。
    1.2.1.3  分离NK细胞  取含4×108PBMC无钙镁PBS悬液9ml，分离、检测方法同分离DC，剩余细胞加入含10% FCS的IMDM培养液培养，实验前加入培养系统（细胞比例为16.5%）。
    1.2.1.4  分离T细胞   取含4×108PBMC无钙镁PBS悬液9ml，分离、检测方法同分离DC，剩余细胞加入含10% FCS的IMDM培养液培养，实验前加入培养系统（细胞比例为82.7%）。
    1.2.1.5  细胞共培养系统   实验前将组分纯化的NK细胞、T细胞和DC按设定细胞比例混合建立CCS，其中NK细胞为16.5%、T细胞为82.7%、DC为0.8%。
    1.2.2 CTL杀伤实验
    1.2.2.1  效应细胞的制备   将丝裂霉素（mito-mycinc,MMC,100μg/ml）加入肿瘤细胞（U251细胞或MCF7细胞，1×106/ml）培养1h，IMDM培养液洗涤3次去除MMC后重悬于10% FCS IMDM培养基中作为抗原细胞（4×105/ml）。将抗原细胞1ml加入12孔细胞培养板，然后加入培养细胞1ml（2×107个，其中NK细胞16.5%、DC0.8%、T细胞82.7%），再加入1ml含量不同细胞因子或抗体的IMDM培养液，37℃5%CO2培养96h后收集细胞，洗涤3次作为效应细胞。
    1.2.2.2  靶细胞的制备　取对数生长期的肿瘤细胞1×106个，加入1.85××105Bq125I-UdR及终浓度为10～5mol的5-氟尿嘧啶，并用完全培养液补足1ml，37℃CO2孵箱悬浮培养2 h，用IMDM培养液洗涤3次，去除未标记的125 I-UdR，γ-计数器计数，平均每个细胞标记率超过1 cpm值，可作为靶细胞应用，靶细胞用含10%FCS的IMDM培养液调整至4×104/ml备用。
    1.2.2.3  细胞毒实验　按不同的效靶比，将效应细胞及靶细胞加入塑料管试管中，补足培养液为1ml(实验均设3个复管)，同时设立靶细胞对照组以测定自发释疑放率。1000r/min分离3min，置5%CO237℃培养12h，2000r/min离心5min，测cpm值。细胞毒活性用125 I-UdR释放百分率表示，按下列公式计算：125 I-UdR释放%=[（实验组cpm值-自发释放cpm值）/（最大释放cpmw值-自发释放cpm值）]×100%。

    2   结果
    2.1   rhIL-18在CCS中诱导肿瘤特异性CTL  将丝裂霉素（MMC 100μg/ml）处理1h 的U251细胞按2%的比例加入CCS（其中NK细胞16.5%、T细胞82.7%、DC0.8%），再加不同浓度的rhIL-18(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)，37℃ 5%CO2培养96 h后收集细胞，以不同的效靶比（1:6.25、1:12.5、1:25、1:50）分别检测对125I-UdR标记的U251细胞的特异性杀伤能力及对K562细胞的非特异性杀伤能力，实验结果表明，在CCS中，rhIL-18能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应，这种杀伤作用具有抗原特异性，U251细胞刺激的CTL只能杀伤U251细胞，而对K562细胞则无杀伤作用。
    2.2  rhIL-18在CCS中诱导肿瘤特异性CTL的抗原特异性  为进一步验证rhIL-18在CCS中对肿瘤特异性CTL的诱导作用。本实验在培养系统中，分别加入经MMC处理的U251细胞、MCF7细胞及rhIL-18(100ng/ml)，培养96h后，分别检测对不同肿瘤细胞（U251、MCF7、PC-3M、K562、HepG2）的杀伤效应，结果表明，以U251细胞为抗原刺激，经rhIL-18诱导产生的CTL，只能杀伤U251细胞，对其他肿瘤细胞无明显杀伤作用（P值均<0.01）；以MCF7细胞为抗原刺激，经rhIL-18诱导产生的CTL，只能杀伤MCF7细胞，对其他肿瘤细胞他无杀伤作用（P值均<0.01）。
    2.3  在CCS中各因素对rhIL-18诱导肿瘤特异性CTL的影响　在经MMC处理的U251肿瘤细胞刺激的CCS中，分别去除100 ng/ml rhIL-18、NK细胞、DC细胞或T细胞，培养96h后检测对U251靶细胞的杀伤能力（效靶比为50:1）。结果表明，在CCS中，只有当rhIL-18、NK细胞、DC细胞和T细胞完全存在时，才能诱导出肿瘤特异性CTL，而当其中任一组份缺乏时，均不能产生肿瘤特异性CTL（P<0.01）。
    3  讨  论
    研究表明,在IL-18基因敲除小鼠中诱导细胞免疫应答(TH1反应),IL-18的加入起着十分重要的作用。Osaki等报道，将能高度表达mIL-18的腺病毒载体瘤内注射，能成功地治疗肿瘤，同时产生特异性抗肿瘤作用，抑制再次注射同型肿瘤的生长，而早期应用抗asialo-GM抗体，能够抑制这种特异性抗肿瘤作用的产生。Micallef等的研究表明，IL-18的体内抗肿瘤作用，最初是NK细胞介导的，继之是诱导的CD4+和CD8+的T细胞。在IL-18预处理的Meth A肉瘤移植鼠，IL-18早期（第3天）增强NK细胞的活性，使IL-10产量增加，IL-2产量下降，随后（第9天）NK细胞的活性及IL-10水平降至正常，而IL-2水平也恢复正常，同时CTL活性明显加强，表明IL-18能相继诱导NK细胞和CTL细胞的抗肿瘤作用。
    目前，IL-18抗肿瘤作用的研究还仅仅处于动物实验阶段，这些作者利用小鼠来源的DC、NK细胞和T细胞亚群，混合后在体外与肿瘤细胞共培养，证明NK细胞对Th1及CTL活化具有辅助作用，这种作用需要首先活化DC。按照这一思路，我们分离了人外周血的上述三种细胞亚群，按接近生理状态的NK细胞相对数量（10%～15%），并加入0.5%～2%的DC，与肿瘤细胞共培养。预试验表明，接近1%的DC为诱导肿瘤特异性CTL增殖的最佳条件。为进一步探讨IL-18在肿瘤免疫生物治疗中的作用机制，验证IL-18在起动和促进肿瘤特异性免疫应答中的作用，本实验建立了人NK细胞、DC和naïve T细胞以及IL-18在内的CCS。研究结果提示，随之DC获取并提示被杀伤的肿瘤细胞抗原，促进naïve T细胞产生肿瘤特异性CTL。CCS中，在肿瘤抗原存在的条件下，96h后rhIL-18诱导产生肿瘤特异性杀伤效应，这种杀伤作用在除去NK细胞后几乎安全被抑制，提示NK细胞在IL-18诱导的肿瘤特异性杀伤作用的起动和促进肿瘤特异性杀伤活性形成的过程中起着重要的作用；对于诱发和维持T细胞应答反应，DC作为最基本的抗原提呈细胞起着十分重要的作用，Mayordome等的研究结果表明，在DC中加入肿瘤相关抗原、肿瘤溶解物均能选择性地激活抗肿瘤特异性CTL。在本文中也证明了，在CCS中，IL-18和NK细胞共同作用诱导产生肿瘤特异性CTL的过程中，DC是一个非常重要的细胞亚群，去除DC，肿瘤特异性CTL的诱导过程明显被抑制，提示了DC在诱导和维持T细胞免疫应答反应中的重要作用。
    综上所述，在rhIL-18诱导肿瘤特异性CTL的过程中，rhIL-18、NK细胞、DC细胞及T细胞均起着十分重要的作用，缺少任一组份，均对诱导肿瘤特异性CTL有明显影响（P<0.01）。IL-18似乎首先通过增加NK细胞的活性作用，诱导快速有效的肿瘤杀伤作用，继之使DC成为有效的抗原提呈细胞，然后，引起强的由CD4+CTL和CD8+CTL介导的特异性抗肿瘤免疫应答。因此提示，IL-18、NK细胞和DC在起动和促进肿瘤特异性免疫应答方面起着重要的诱发和中介作用。

摘自《现代免疫学》2004年第4期