丁朝建  刘  琼  徐辉碧

              (华中科技大学化学系，武汉430074)

    摘要：端粒是真核生物染色体末端的DNA与特殊蛋白质结合的复合体。端粒酶是一种由蛋白质和RNA组成的核糖核蛋白复合物，具有逆转录酶的活性。除末端复制问题是端粒DNA缩短的原因之外，氧化应激也能加速端粒缩短，而抗氧化剂则能延缓端粒缩短率。氧化应激对端粒酶活性的影响仍不确定。研究表明氧化应激是端粒缩短及其所致细胞衰老的重要调节因子。
                                    
关键词：氧化应激；端粒；端粒酶；复制衰老；hTERT
                                   

    端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，由极端保守的六联体串联重复序列和与之结合的特殊蛋白质组成。端粒维持染色体的结构稳定和功能，保护它免受核酸酶降解，防止其末端融合或重排[1]。人体细胞端粒平均长度一般为5～15kb，随着细胞分裂每次缩短30—200bp，这种现象称作末端复制问题，是由于复制过程中DNA聚合酶不能填补后随链3''-末端缺口所造成，它导致端粒逐渐缩短[2]。当端粒缩短到某临界长度时，不能再保持染色体的完整性，细胞则发生衰老或凋亡。但是从四膜虫中发现了一种端粒酶，它能延长端粒3''—末端补偿末端复制造成的损失。端粒酶是一种核糖核蛋白，主要由端粒酶逆转录酶(hTERT)和RNA组成，其中RNA作为端粒合成的模板序列。
                                            
    除了末端复制问题造成的端粒缩短外，氧化应激也加速端粒缩短，从而加快细胞衰老与死亡，抗氧化剂则减少端粒缩短，延缓细胞衰老进程。因此研究氧化应激对端粒和端粒酶的影响、作用机制是揭示细胞衰老过程的一个重要方面，对延缓细胞衰老和抑制肿瘤发生有一定的意义。
                     
1．氧化应激与端粒、细胞复制衰老
                                           
      Hagflick首次观察到体外传代细胞的复制衰老现象，正常细胞一般经过有限的细胞分裂次数后便衰老和凋亡。Harley等[3]发现体外培养的人类成纤维细胞的端粒有逐渐缩短的现象，端粒与细胞复制衰老首次被联系在一起，复制衰老的端粒假说也被提出，它的基本观点是端粒缩短到某个临界值将触发衰老，其次端粒以稳定的速率缩短，端粒长度是复制历史的准确指示器。有很多的证据支持该理论。但该假说不能解释细胞复制衰老的差异性，即来自同一个细胞系的不同细胞的分裂繁殖能力具有很大的差异，这种现象说明端粒缩短具有随机性。端粒缩短的随机性是由于后随链合成时末端引物定位的随机误差、端粒的重排和氧化应激造成的端粒DNA单链损伤引起的[4,5]，其中引物定位误差和随机重排都受到氧化应激造成的端粒DNA位点损伤情况的影响，因此氧化应激通过损伤端粒DNA而加速端粒缩短，从而加快细胞衰老。不仅伴随着端粒缩短的细胞多次分裂之后产生细胞衰老，长期的亚致死剂量的氧化应激也会产生同样的结果。在细胞自身长期处于氧化应激状况下[6]，或用能造成轻微的氧化应激的低剂量的叔丁基氢过氧化物、H202等处理细胞，均能导致端粒缩短率增加和细胞寿命减少，而细胞体内自身抗氧化能力足够高时会减轻氧化应激的影响[7]，各种抗氧化剂如营养物维生素C[8]、维生素E和β-胡萝卜素，不仅能减少氧化应激条件下的端粒缩短，而且能延长细胞的寿命。
                                   
2．氧化应激引起端粒缩短的机制
                                            
     人类包皮BJ成纤维细胞系具有很好的抗氧化应激能力[7]，其复制性衰老的寿命是90次，端粒缩短率大约是每次分裂缩短10～20bp，该值可能是端粒缩短的最低限值，它仅由末端复制问题造成的，而在其他细胞系中，观察到了较快的端粒缩短率，一般为50bp／次，同时细胞内也存在较高的过氧化物量，指示其较低的抗氧化能力。说明端粒缩短加快，主要是氧化损伤造成的，氧化应激引起的端粒长度缩短量比末端复制要高得多。端粒特别是富含碱基C的重复串联结构，与基因组其他处相比更容易受到氧化应激的损伤。氧化应激使碱基G被氧化[9]，特别强烈的氧化应激使端粒受到严重的损伤，引起端粒在非复制条件下断裂缩短。在正常培养条件下，Von  Zglinicki等[5]认为人类成纤维细胞的端粒缩短主要是氧化应激造成的端粒单链损伤累积的结果。将人类MRC-S成纤维细胞系保持融合状态3个月，使细胞受抑制不能增殖，细胞端粒长度保持不变，却发现端粒单链损伤位点密度增加了4倍，且细胞一旦被允许增值，端粒缩短速率则很快，为连续增殖的细胞缩短率的3倍，说明非增殖期单链损伤累积导致了短时期的较高端粒缩短率[10]。端粒单链损伤累积的原因是修复被氧化应激或烷基化破坏的端粒单链损伤处的能力，比修复基因组其他处的同样损伤的能力差很多[11]，其修复端粒单链损伤所需的时间也较长，导致未修复的核苷酸或损伤碱基干扰端粒的复制，使复制过程立即停止，从而加大了端粒末端丢失的长度。用核酸酶S1处理并用碱性凝胶电泳显示，端粒上存在的单链损伤位点密度比基因组其他地方高。端粒单链损伤的修复能力差的原因，可能是端粒t环结构妨碍了修复蛋白质接近端粒单链损伤处，使其难以发挥修复作用[12]。
                                   
3．氧化应激与端粒酶
                                           
      Saretzki等[13]发现，氧化应激能使U87恶性胶质瘤细胞产生单链富含C的DNA片段，并使细胞生长停滞，而用富含C的DNA片段处理则能短时地抑制其生长，并出现延迟的端粒酶激活和端粒延长。说明氧化应激是端粒缩短的主因，当端粒缩短至一定长度，可能会使hTERT基因转录而激活端粒酶，导致肿瘤细胞产生。Szalai等[14]发现，人类端粒的重复序列(TTGGG)中，G易被氧化成7，8—二氢—8氧鸟嘌呤(80G)，而80G位于GGG三联体中的位置会影响端粒酶活性和端粒重复序列的合成。当80G取代GGG三联体的5''-端时，端粒酶活性显著下降，而当80G取代GGG三联体的中间位置时，对端粒酶活性无影响，因此，端粒上的G氧化成80G有调节端粒酶活性的能力。氧化应激有可能通过介导不同位置C的氧化，从而间接调节端粒酶活性。有趣地是，Huang等[15]构建了一个无端粒酶活性域的27kD的hTERT的C端多肽表达载体，发现其低水平表达时，致使hTERT阳性的Hela细胞对过氧化氢诱导的氧化应激变得敏感和随后发生衰老，说明hTERT的C端具有hTERT介导的抵抗氧化应激的作用。而Ren等报道，羟基自由基仅造成端粒缩短而不改变端粒酶活性。目前两者之间的相互作用尚不完全清楚，有待进一步研究。细胞衰老的主要机制是端粒缩短，端粒缩短又依赖于氧化应激。由于每次分裂时细胞外部氧化应激和内部抗氧化能力的不同，因此细胞衰老的速率和端粒缩短依赖于细胞氧化应激程度和抗氧化能力的综合平衡。由此可见，减轻细胞氧化应激程度和增加抗氧化能力对延缓端粒缩短和增长细胞寿命具有重要意义。相反，氧化应激也可应用于肿瘤基因治疗，加速肿瘤细胞死亡而达到治疗的目的。

      参考文献
  [1]    Zakian  VA.  Science,  1995,  270:1601--1607
  [2]    Levy  MZ  et  al.  J  Mol  Biol,  1992,  225:  951--960
  [3]    Harley  CB  et  al.  Nature,  1990,  345:458---460
  [4]    Rubelj  I  et  al.  J  Theor  Biol,  1999,  197:  425--438
  [5]    Von  Zglinicki  T  et  al.  Free  Radic  Biol  ivied,  2000,  28:64--74
[6]    Tchirkov  A  et  al.  Hum  Mol  Genct,  2003,  12:227--232
I7]    Lorenz  M  et  al.  Free  Radic  Biol  Med,  2001,  31(6):  824--  82831 
[8]    Fummoto  K  et  al.  Life  Sci,  1998,  63(11):  935---948
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[10]    Sitte  N  et  al.  Free  Radic  Biol  Med,  1998,  24:  885--893
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[12]    Von  Zglinicki  T  et  al.  Ann  NY  Acad  Sci,  2000,  908:99--110
[13]    Saretzki  G  et  al.  Oncogene,  1999,  18(37):  5148--5158
[14]    Szalai  VA  et  al.  J  Am  Chem  Soc,  2002,  124  (  8  ):  1625--1631
I15]    Huang  J  et  al.  Biochem  Biophys  Res  Commun,  2003,  301:  627--632
[16]    RenJGetal.  FEBSLett,  2001,  488:123--132

摘自；中国生物化工网