作者：Paul R. billings, MD, PhD和Matthew P. Brown, PhD

    2001年，随着人类基因组图谱及初步分析结果的公布，三种新的工作也接踵而至。首先是需要解决的技术问题：由于基因序列并没有全部完成，还需要序列错误纠正和有选择的确认，以及随后要求修订的资料说明等。这一重要工作的进行使得人类基因总数的估计数目较原来相比已大为减少至25，000个左右。现在这一工作即将完成，充分修改后的人类基因组序列和相应解释对其今后的应用将是至关重要的。

   其次，作为人类基因组计划(HGP)一部分的信息需要与其它已知有关人类多样性的信息进行比较，从而构成一整套新的对比研究的基础，这对发展和进化中的生物学以及人类学的研究来讲是必要的。例如与基因组相比，人类蛋白组的完成要难的多。扩增基因组信息的机制包括信使RNA(mRNA)的连接、翻译和翻译后变化。此外，构建功能性基因组所需要的最小基因数的提议也直接来自于比较基因组学和HGP的结果。基因组学研究的进展将继续帮助人们在人类多样性上获得新的见解和明确人类在生物世界中扮演的角色。

    最后是人类基因组序列相关工作在临床上的直接应用。作为HGP的一部分，用于基因材料分离、处理和分析的方法得到了改进。人们发现了以前不知道的基因和修改后的脱氧核糖核酸（DNA）序列，也创造出了重要的生物信息工具以帮助发掘基因学信息和明确其与临床资料的关联性。在一些情况下，这些进展会对现有的实验方法和临床信息进行补充；在另外一些情况下，这些进展或许成为创建新型临床实验室检测方法的"破坏性"创新和发现。总而言之，把从HGP中获取的成果用于临床是很关键的。
本文将通过对下列议题的回顾来帮助理解基因组学的进展将对临床实验室造成什么样的影响：

  目前使用的检测与方法:

  未来几年内将有可能成为实验室检测菜单主要部分的一些新的重要检测程序和检测方法；

  高质量临床基因组学检验所要求的新设备、技能和补充性的服务类型；

  不同目标、规模和资源的临床实验室如何在分子生物学和基因组学领域进行持续创新和应用方面的一些建议。

  临床实验基因组学：一个框架

  从技术上讲，基因组学和基因学检测意味着对修改其特性或状况的基因组内的许多或全部因素进行评估。所以基因检测传统上主要涉及对相关单个基因位点的评估。在当今的临床实验室检测范围中，除了多等位基因（如囊肿纤维变性的DNA检测）的分子学评估和一些新的肿瘤学检测外，大部分检测都属于遗传性检测。这些检测包括生化、细胞遗传学和分子学方法等。

    生化遗传学检测是最常用的检测方法。它通过对蛋白产物的检测和临床病史来推断相应的基因型。其代表是激素或其它作为联合检测一部分的分析物的传统检测方法，这些方法通常用于妊娠期胎儿风险评估（每年约250万）或新生儿风险评估（经Guthrie spot检测每年约400万）。用于细胞学和显微病理学标本的各种免疫组织化学(IHC)方法主要用来评估代表临床重要基因存在或活性的蛋白表达。IHC主要用于恶性细胞和组织的检测和再分类--例如，乳腺癌细胞上雌激素受体基因表达产物的存在特征。
细胞遗传学主要用于胎儿和肿瘤学方面的评估。羊水诊断加上胎儿细胞的染色体组型分析是常用的检测方法（每年约30到40万）。在骨髓标本、肿瘤和其它来源的肿瘤细胞（如血液、尿液、粪便、呼吸道分泌物）中寻找所有隐匿的染色体变化的方法已经非常成熟和普及。荧光原位杂交（FISH）既提高了染色体分析的速度、也扩大了它的用途，目前其检测量也在相应增加。

    分子学分析最常用于检测准备受孕者是否为囊肿纤维变性相关风险等位基因的携带者（每年约100万），以及评估复发性深静脉血栓或肺部栓塞患者是否有与Factor V Leiden相关的基因（每年约20万）。HIV和HCV的分子学定量检测和分型正在越来越多地用于确认和监控感染以及决定治疗方案。大量的其它分子学检测（尽管不常用）正被用于诊断或鉴定与基因改变有关的风险性。癌症出现的突变表现可以被用于监控癌症负担或治疗反应（如慢性骨髓性白血病的BCR-ABL熔和基因）。

     分子学分析方法包括DNA的直接测序、能检测到单个核苷变异（单核苷多态性或SNPs）的高灵敏度探针杂交、或采用生理化学方法检测DNA序列中的突变的方法。所有这些方法通常在聚合酶链接反应（PCR）对DNA扩增后使用，从而保证其高灵敏度。

   临床实验基因组学的扩展

    除了极少的例外，分子检测或分子技术在普通临床实践中的使用是有限的。而相类似的人体所经历的疾病风险特征（对环境因素或治疗干预的反应、确定对特异性治疗的高/低反应和可能经历的副作用--药物基因组学范畴）模型已被证明具有广泛的临床用途。事实上，临床基因组学及其方法最有可能的早期应用将会加强现有的高通量检测。

    例如，高灵敏的生化分析与精确诊断成像的结合可以在妊娠早期增强对胎儿的疾病筛检。质谱学平台的展开可以对新生儿进行与罕见的遗传代谢紊乱相关的多种生化分析。可以快速和重复性的进行基因或其表达检测的生物芯片将能够对肿瘤、炎症和心血管疾病的标准病理学诊断进行补充。用于对感染原或人体宿主反应（药物基因组学）进行检测和再分类的类似平台技术也将逐渐进入实际应用中。

     要将所有这些基因医学的前景变为现实尚需要克服许多障碍。首先，这些方法应当在改进临床诊断结果的同时降低成本；此外，为使新的检测技术能够被充分使用，这些检测技术的供应商需要为医生和病人提供更多的宣传培训。技术评估的过程也需要改进，以便新的具有较高特异性和灵敏度的技术和检测能继续以合理的速度从研究阶段进入临床实验室。只要技术、经济、法律和伦理方面的问题能够解决，临床实验分子检测技术的发展无疑将继续下去。

   临床实验基因组学的发展

   核酸扩增技术

  大部分DNA基因检测技术采用PCR扩增技术。在微卫星不稳定性（MSI）检测中，PCR可直接用于测定DNA序列的变化。为检测和监控RNA，可以采用逆转录PCR（RT-PCR），即首先将mRNA逆转录生成cDNA，再进行PCR。实时定量PCR主要用于监测RNA转录中的变化，该技术对病原体的定量分析和SNP基因分型非常有用。

   此外，这些技术可用于定量分析由mRNA转录水平决定的基因表达水平（定量逆转录PCR或QPCR）。在DNA芯片扩增技术中，扩增直接在玻璃芯片表面上进行，结果通过荧光扫描而不是电泳分离来显现。芯片PCR可用来确定人类基因组DNA的SNPs或检测和鉴定病原体。用于核酸扩增的方法大多复杂，PCR循环复制已经被用于高通量SNP检测；全基因组扩增也已通过多重移位扩增技术完成，它是循环复制技术的延伸。不采用PCR的DNA检测技术也正在被研发，这些技术将有望克服聚合酶的一些局限性。新近公开的技术采用纳米技术来开发快速医学诊断试剂。该技术采用纳米金颗粒、磁分离和DNA芯片检测，据称能在一个标本中检测出只有10个DNA分子的量。

   染色体成象

    传统的染色体组型以条带模式来染色确定染色体。光谱染色体组型采用染色体特异性荧光探针来标记每一条染色体，检测则采用一台干涉仪来完成。该技术对于传统染色体组型难以检测到的如易位等染色体结构变化非常有用。

    FISH用于研究已有20年，1997年被美国FDA批准用于产前诊断。现在FISH已成为临床实验室检验的一部分。这种方法较为简单：即荧光标记的DNA探针与中期伸展的染色体或与固定在载玻片上的标本细胞分裂间期核酸杂交，探针与染色体的结合可通过荧光显微镜进行观察。FISH比标准IHC技术昂贵，但具有更高的灵敏度与特异性。因此，在某些情况下，FISH被推荐用来对IHC的不确定结果进行确认，而不是用作初筛工具。FISH可以准确地检测到染色体及其结构的细微变化，这些变化与一些临床症状有关。

    传统的比较基因组杂交（CGH）提供了整个基因组染色体复制数目的信息。不同标记的检测DNA与正常参考DNA同时与正常延伸的染色体杂交。用两种不同的荧光染料可检测到杂交，荧光比率的测定可采用激光芯片扫描仪和数码影像分析仪。目标基因组的增加或扩增可以通过一种荧光染料的过量观察到，而目标基因组的消除则可以通过另一种荧光染料的过量观测到。

    微阵列比较基因组杂交是一项更为强大的技术，能在小的基因组区域内检测高水平的扩增和纯合子的缺失。该技术使用大量的嵌入克隆、如作为探针的基因组DNA细菌人工染色体（BAC），并采用不同标记的测试和对照DNA作为检测目标。微阵列技术已被用于检测乳腺癌、肾癌和膀胱癌中高分辨复制数目变化。由于采用了基因组克隆序列数据，因而这项非常有用的技术可以用在诊断和目标治疗过程中对与疾病相关的基因进行快速的鉴定和克隆。微阵列技术可以在没有细胞培养和染色体染色的情况下通过分子染色体组型对医学细胞遗传学领域进行革新。微阵列技术的另一项优势是其检测过程可以被重复或复制，这在单基因突变检测方法中并不多见。

   基因组学技术

    功能性基因组学主要包括人类基因组内的基因研究、基因功能的确定以及对与疾病风险度相关的等位基因多态性的鉴定等，这也是临床实验室最感兴趣的。然而功能基因组学的最终目的是了解遗传信息是怎样通过mRNA（转录）形成蛋白（蛋白组学）、再从蛋白到其代谢物（代谢）从而最终发挥生物功能或出现功能障碍的。系统生物学经常被用作功能基因组学的同义词，用来描述基因组学和后基因组学的特性与它们在环境变化时的相互影响。药物基因组学所提供的基因变异信息为优化药物功效、减轻药物毒性和选择理想的治疗方案提供了帮助。

    固相芯片技术包括一个已知的DNA序列或一个用于固体底物上的探针。探针通常由小片段的寡核苷酸、蛋白核酸（PNAs）或互补DNAs(cDNAs)组成。与探针杂交的目标DNA通常表现为荧光标记cDNA或基因组DNA片段。一旦目标DNA与探针的杂交发生，就会进行数码扫描。所得到的数据随后会进行杂交模式和荧光强度的分析。DNA芯片技术提供了DNA序列变异的数据（突变和多态性）以及基因表达水平。在基因表达的研究上，目标DNA可以是cDNA合成过程中被不同标记的正常和紊乱细胞转录本的混合物。表达的序列标记也可作为目标DNA.。不同的荧光信号可以记录与一个或两个探针的斑点杂交。基因表达图谱能确定向上和向下调节的基因，因而可以用于新颖的治疗观察。cDNA芯片也已经被用于划分特殊性障碍的病理亚群。当多态性被确定后，基因组DNA可以和寡或PNA探针合用来明确等位基因的不同。寡核苷酸芯片已被定义为DNA芯片。芯片技术的新进展包括液相芯片技术的使用，例如以微珠为基础的多元检测可以在同一个孔内进行多项分析。

  蛋白组学技术

   蛋白组学主要用于了解一个特定基因组编码的所有蛋白的结构、功能和表达，它包含了作为了解年龄、状态和环境功能的蛋白表达图谱；此外也可用于后翻译修饰和蛋白大分子相互作用的研究。蛋白组学的目的是确定一个特定组织中的蛋白成分、蛋白与蛋白间的相互作用和蛋白结构。蛋白组学的关键技术是采用双相PAGE（2D-PAGE）分离蛋白。随着分离技术和荧光蛋白染色的进步，目前已有10000个以上的蛋白可以采用2D-PAGE进行解析。采用凝胶消化酶对2D-PAGE分离后的蛋白质点进行降解，产生的肽可以通过质谱（MS）进行肽指纹谱分析。

     质谱技术包括肽片段的离子化和随后的单个片段质量与电荷的检测。肽指纹谱测定采用的是将每个片段的质荷比与已知基因序列的质荷比进行比较来得出结果。目前在用的质谱技术有许多，根据所要求的样品准备和应用对象而有所不同。结构和序列数据可以通过串联质谱技术（MS/MS）获得，即用一台质谱仪测定肽质荷比，然后采用碰撞将样品做进一步分裂，再通过第二台质谱仪传送碎片。上游液相色谱（LC）分离技术模仿2D-PAGE的蛋白分离技术，LC-MS/MS寻求的是提供结构和序列的数据，可以自动化操作。质量分光镜与能进行敏感模式识别的生物信息软件的结合最近已经被用于测定和早期卵巢癌有关的诊断蛋白模式。

    蛋白组学分析也正在朝着采用蛋白微阵列的自动化芯片技术迈进。蛋白微阵列采用能与其它蛋白或分子特异性相互作用的蛋白探针，用来识别蛋白与蛋白之间、酶与底物之间以及抗体与抗原之间的相互作用。

   现有的药物基因组学检测

    慢性髓细胞性白血病（CML）是最常见的白血病之一。大多数的CML起因于染色体的异常，即含有多数原癌基因c-abl的第9染色体中的DNA易位到了22染色体上。这就导致了表达具有酪氨酸激酶活性的蛋白融合基因的形成，进而影响到细胞内的信号通路，造成无节制的细胞增殖。CML的分子学诊断可以采用QPCR，FISH能用来观察易位染色体。作为BCR-ABL酪氨酸激酶选择性抑制剂的口服药imatinib(Gleevec)已经显示出比常规药物更为优越的疗效。药物基因组学检测可以监控对该药物的反应或耐药性的发生。

     Her-2/neu原癌基因在25%到37%的乳腺癌患者中有活性。细胞表面Her-2人表皮生长因子受体的过度表达刺激了肿瘤的生长，并与临床预后不佳有关。采用IHC或FISH方法可以检测Her-2。只有检测过Her-2的病人才能进行Herceptin治疗，因为该治疗方案非常昂贵，并且其疗效在其他病人体内未得到肯定，而且还发现在接受治疗的病人中有12%会出现轻重不等的心力衰竭。

    遗传性非息肉性大肠癌（HNPCC）是结肠癌中最常见的遗传原因，占所有结肠癌病例的2%到5%。它是由至少5个DNA错配修复基因中的任何一个的突变引起的。HNPCC综合征会使一个人在年轻时即发展成为结肠癌。在HNPCC家族中已经开展了症状发生前和易患病体质的检测。HNPCC病人中有大约90%的肿瘤显示微卫星不稳定性（MSI），因而检测MSI将有助于了解未来分子特征。基因测序可以用来确定突变，突变数据加上DNA MSI检测结果能被用来确定HNPCC的家系成员。一旦临床资料提示可能为HNPCC，则应对肿瘤组织进行IHC检测以明确诊断。

     Thiopurines、硫鸟嘌呤和硫嘌呤是常用的抗肿瘤药。Thiopurine转甲基酶（TPMT）催化了thiopurines的甲基化，TPMT基因是多形态的，每300个病人中会有一个缺乏酶活性。这使得在标准剂量的情况下也会导致thiopurines的毒性积聚，而这种积聚会是致命性的。三种突变占了突变等位基因的大多数，对此已经可以进行遗传学检测。接受这些药物治疗的白血病患儿通常会进行缺陷基因的常规筛查。

   药物基因组学检测前景

    药物毒副作用会导致6.7%的病人住院治疗和0.32%的死亡率。药物基因组学可以描绘出与药物反应相关的基因变异，因而有可能降低这些数字。这些基因大部分与编码受体、参与代谢的酶和代谢转移性蛋白的过程相关。正是这些基因与环境毒素的敏感性和癌症的易患体质有关。

    药物功效直接与药物分子与细胞表面受体的结合有关。例如，具有高浓度?-肾上腺素受体表达的病人对?-兴奋剂和拮抗剂的反应性更强；相反，那些表达低浓度?-肾上腺素受体的病人则需要更高的药物浓度才能达到相应的药理学效应，但这可能会导致出现药物的毒副作用。药物一旦进入细胞内，就会受到一些酶的催化代谢而发生改变。其中一类代谢酶是细胞色素P450，它有40多种同功酶。这些酶能代谢大量的药物、致癌物、小分子、诱变剂和因修改双亲分子功能组而出现的致癌物。基因CYP2D6的多态性可导致隐性无活性纯合子基因型的出现，这样就不能将可待因转变为活性代谢产物吗啡。该基因型在人群中的发生率约6%。CYP2D6至少有六种多态性，这些多态性的表型（超速、广泛、中间和缓慢）可对许多药物的代谢产生影响。FDA目前正在考虑建立一个P450分子微阵列。

     代谢产物也可因其它因素的变化而发生改变。乙酰化作用对很多药物来说是一个重要的变化过程。N-乙酰转移酶(NAT)具有代谢和芳香胺解毒的功能。NAT2多态性可出现缓慢、中间和快速的乙酰化个体型。缓慢乙酰化个体型的病人其药物毒副作用的风险性较高；此外，缓慢乙酰化个体型病人患膀胱癌的风险性也比较高，如为吸烟者则风险性更高，因为香烟中含有致癌物质芳香胺。谷胱甘肽S转移酶（GST）参与抗氧化剂的防御作用，GST多态性可以对一些化疗的反应和毒性进行预测。此外，几个GST基因的缺失与患癌症的风险升高相关。代谢性酶的单克隆抗体与其它技术的联合可以明确在影响药物代谢、解毒和癌症易患性过程中特异性基因的角色。转送蛋白能将药物送达合适的目标并排斥异生物，一些转送蛋白的突变与一些疾病相关，最明显的是与囊性纤维化有关的囊纤维化跨膜调节(CTFR)基因的突变。

  结   论

    来自人类基因组计划的资料与基因组学和蛋白组学技术的结合将使检验医学发生显著变化。目前对提升现有检测、新的平台和新的生物信息学的需求已经出现。然而要想所有这些新方法成为现实，还需克服诸多挑战。有些是很现实的，如基因组学检测必须能以较低的成本来改进临床结果。在临床检验基因组学被普遍应用之前，首先需要研究与澄清大量规则、教育和法律方面的问题。

    一个主要的挑战是检测的发明者要证明他们的发明价值。在基因组学检测方面很少有关于成本方面的考虑。1968年，世界卫生组织（WHO）确立了疾病筛查的原则，其中包括用于预防疾病的有效药物治疗、用于有效预防的早期诊断和通过遗传学检测进行预测性诊断的可行性。药物基因组学的性价比考虑策略应结合这些因素，即应考虑到多态性在人群中普遍存在且外显率很高、基因学检测的灵敏度和特异性均很高、发病率和死亡率都很高的疾病、治疗费用很高等。如果按照这些标准，则肿瘤学是最适于使用药物基因组学的领域。

     一个特殊的性价比分析例子是在预防abacavir过敏反应时对人白细胞抗原(HLA)B*5701基因型的检测。Abacavir是一种核苷类似物，当单独或是与其它药物联合使用时，可以作为HIV逆转录酶的有效抑制剂。约有4%到8%的病人使用abacavir时会出现威胁生命的低血压过敏反应。在对abacavir过敏的高加索人中，HLA B*5701已经被证实为与其有关的一种高风险遗传因子。因而在采用abacavir前对该等位基因进行基因分型可减少abacavir过敏反应的发生率。对于大部分的临床假设来说，治疗前进行基因分型检测具有良好的性价比，将有助于了解诸如HIV治疗的费用支出状况。

    临床机构对费用的另一个担忧是开展基因组学检测所需的基础设施。基因组学技术所需要的仪器设备与目前临床实验室使用的截然不同。无论是芯片仪、液相微阵列仪、质谱仪、实时PCR仪或其它所需的仪器设备，都需要额外的支出；此外还要考虑到实验室工作人员的培训费用等。因此，从检验医学转换到基因组学检测时，需要考虑到上述费用的支出。

    与人类基因组学整个领域一样，临床实验基因组学也在快速发展。实验室操作以及快速传递给病人与医生所需要的信息系统建设也进行的很快。考虑到成本因素，小型实验室可能难以开展较为全面的高质量检测项目。进行这类检测的实验室必须有大量和持续的资金支持以及在缺乏临床实验数据的情况下进行技术评估的能力。开展一项检测的潜在支出--如对检测与方法的专利权相关的研究与磋商的法律费用--必须被考虑进去。虽然这些不确定因素和其它所面临的挑战令人有些沮丧，但作为临床实验基因组学一部分的新检测和信息的发展将会继续成为一道"亮丽的风景线"。

摘自：《美全诊断论坛》2005年第2期