马越         金少鸿

　　20世纪后期。抗生素的发现和应用控制了大多数由细菌引起的感染，明显降低了与感染相关的死亡率。但细菌耐药性的出现和传播使得某些抗生素逐渐失去其抗菌活性。抗生素耐药性的全球化，耐药菌株的传播，要求我们必须进行全球范围的细菌耐药性监测和研究工作[1-3]。
　　一、 细菌耐药性监测网
　　（一） 国内细菌耐药性监测网
　　国内大型监测系统包括经上海复旦大学附属华山医院抗生素研究所汪复教授为代表，有 11家医院参加的上海地区监测网；以北京大学临床药理硬件民李家泰教授和中国医学科学院北京协和医院陈民钧教授分别代表中国细菌耐药监测研究组和医院内病原菌耐药性监测网，是国内跨地区细菌耐药性监测网网络，分别涵盖全国9个城市13家大型医院和10个城市32家医院；国家细菌耐药性监测中心组织建立的国家细菌耐药监测网，至今已在全国9个省、市、自治区建立了地方监测网，80余家医院参加中心组织的临测工作[4]。此外，为了解不同级别医院细菌耐药性现闭状，还在湖北省中等城市、县级医院建立了不同层次的监测网点，其目的就是通过不同地区、不同级别的医院细菌耐药性监测数据收集和分析，阐明我国不同层次医院临床细菌分离株耐药性差异。
　　（二） 国际细菌耐药性监测网
　　1994卫生组织总部传染疾病监测控制处理负责指导、协调各国的细菌耐药性监测工作。世界卫生组织细菌耐药性监测合作中心主任Thomas O′Brien教授启动了旨在收集全球细菌耐药性监测数据的WHONET系统。现国内、外多数监测网使用的分析软件属该系统。此外，约有315个医院和400多个实验室分别参加了美国医院感染监测系统（NNIS）和欧洲耐药性监测网（EARSS）。
　　二、 临床常见细菌的耐药性
　　看年来，细菌耐药性的监测研究重点包括：（1）耐甲氧西林的葡萄球菌和耐氨基糖苷类抗生素的多生耐药的葡萄球菌；（2）耐万古霉素的多重耐药的肠球菌；（3）耐β内酰胺类和大环内酯类的多重耐药和肺炎链球菌；（4）产超广谱β内酰胺酶及AmpC酶的革兰阴性杆菌；（5）非发酵糖菌群的多重耐药问题等[5]。
　　（一） 耐甲氧西林葡萄球菌
　　青霉素结合蛋白是细菌细胞壁全成过程中维持其生理功能不可缺少的酶蛋白系。β内酰胺类抗生素通过与细菌主要PBPs结合，使细菌胞壁全志过程中的交叉连接不能形成，由此影响黏肽的合成，致使细胞不能合成细胞壁而溶菌死亡。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）是由结构基因mecA编码产生青霉素结合蛋白PBP-2a。我国医院MRSA占金葡菌的40%~90%，高发区在烧伤病房、外科病房重症监护病房，多见于皮肤组织、伤口感染，带机呼吸的下呼吸道感染、心内膜炎、菌血症等[5]。
纸片法检测葡萄球菌对甲氧西林的敏感性是用1ug的苯唑西林纸片，由于常出现假阳性现象，因此，2004年美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）[6]建议用30ug的头孢西丁纸片替苯唑西林检测mecA介导的葡萄球菌耐药。结果应报苯唑西林耐药，而不是头孢西丁耐药。判定标准为金葡菌头孢西丁抑菌环直径小于等于19mm为苯唑西林耐药；≥20mm苯唑西林敏感。凝固酶阴性葡萄球菌头孢西丁抑菌环直径≤24mm为苯唑西林耐药；≥25mm为苯唑西林敏感。
　　有效控制耐甲西林葡萄球菌感染的流生，准确地检测是关键。常规药敏试验易受酸碱度、温度、盐浓度等因素的影响。聚合酶反应（PCR）和DNA探针杂交检测mecA基因具有特异、准确的优点。尤其是临界耐药菌株（MIC 0.5~8.0ug/ml）中，用普通药敏试验方法容易出现错误，更需采用PCR和DNA探针杂交先等分子生物学方法进行检测。Francois等[7]采用多重定量PCR技术，可直接对临床标本进行MRSA和表皮葡萄球菌的快速检测。首先采用免疫磁珠法收集金黄色葡萄球菌并提取细菌的DNA，然后采用多重定量PCR对金黄色葡萄球菌DNA下列片段同时进行扩增：mecA和femA基因以及表皮葡萄球菌的femA基因每次可检测30份标本，它与最佳的细菌培养鉴定技术相比，该方法敏感性很好，且整个检测过程可在6h内完成。
　　自1996年第一株对万古霉素中介的金黄色葡萄球菌（VISA）由日本报道以来，万古霉素敏感降低的金葡菌备受关注。2002年7月美国疾病控制中心确证并分布了世界第一例真正的万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（VISA），此后又有两例VRSA的报道。国内文献[8]曾报道异质性VISA。Wilcox等[9]对英国的3713株金黄色葡萄球菌（其中39%MRSA）的调查表明，仅6株（0.16%）为异性VISA。目前VISA在临床上的检出率并不高，这一耐药现象尚不是当前金黄色葡萄球菌的主要耐药问题，其重要性体现在耐药发展趋势上。用纸片扩散法来鉴定糖肽类抗体素中介或耐药的葡萄球存在敏感和特异性问题，原因是中介株中纸片扩散法可能会在敏感的判定范围内[10]。自动化药敏鉴定仪如MicroScan、VITEK及WITEK 2也不能对万古霉素耐药金葡菌的MIC进行准确鉴定，其万古霉素的MIC常在敏感范围内[11]。因此，含6 ug/ml万古霉素脑心浸液筛选平板，肉汤和琼脂MIC法，浓度梯度法仍然检测万古霉素非敏感葡萄球菌的推荐方法。
　　（二） 肠球菌
　　肠球菌对万古霉素耐药主要有5种表型VanA、VanB、VanC、VanD和VanE，分别由不同的耐药基因簇编码，除VanC为天然耐药外，其余均为获得性耐药。VanA对万古霉素和替考拉宁呈高水平耐药；VanB对万古霉素呈不同程度耐药，对替考拉宁敏感；VanC对两种抗生素呈低水平耐药。耐万古霉素肠球菌实验室检测主要有纸片扩散法、琼脂筛选法和分子生物学等方法。纸片扩散法在检测VanC型肠球菌时容易漏检，分子生物学方法如PCR方法灵敏度较高。有文献介绍用多重PCR检出10株对万古霉素耐药或中介肠球菌[12]，其中4株基因型为VanC1，3株为VanC2，VanA型1株。国内肠球菌对青霉素和氨基糖苷类抗生素修饰灭活。肠球菌中的氨基糖苷钝化酶主要为双功能酶AAC（6〞）-APH（2〞），表达这种双功能钝化酶的基因为aac（6〞）-le-ph（2〞）-la另一种基因为aph（2〞）-ld也与氨基糖苷高度耐药性有关。
　　（三） 耐青霉肺炎链球菌（PRSP）和耐氨苄西林的流感嗜血杆菌
　　自1967年第一株PRSP发现以不，在世界范围内有关PRSP流行、传播的报道不断增多。Muhlemann等[13]对呼吸道感染儿童鼻咽部肺炎链球菌的携带状况调查结果显示，从急性中耳炎或肺炎门诊患儿（＜17岁）的鼻咽拭子分离培养出1176株肺炎链球菌，平均携带率为43%。回归分析结果显示，年龄（＜2岁）和近期抗生素使用史是PRSP携带的危险因素。
　　北京、上海、广州和西安四地区654株肺炎链菌耐药性监测的数据显示，不同地区青霉素非敏感率在14%~60%，且上海和广州地区的较北京和西安高[14]。王辉等[15]2002—2003年对北京、上海、沈阳、杭州和武汉地区社区获得性感染肺炎链球菌耐药率调查表明，不同地区间肺炎链球菌对青霉素的非敏感率存在较大差异。此外，上述资料表明，这国肺炎链球菌对青霉素的耐药性在逐年上升。但肺炎链球菌临床分离株对阿莫西林/克拉维酸及三代头孢菌素较好的敏感性[14，15]。PRSP多重耐药主要以红霉素、四环素、复方磺胺甲恶唑及氯霉素为主。我国肺炎链球菌对红霉素耐药率很高，高耐株（MIC≥256ug/ml）占耐药菌株的80%~90%。
　　肺炎链球菌对大环内脂类的耐药主要是由于（1）核糖体靶位点的改变；（2）主动外排机制增强；（3）产生修饰酶。Erm基因编码23SRNA甲基化酶而使核糖体靶位点改变，此机制可以引起大环同酯类、林可霉素类、链阳菌素B的交叉耐药。即MLSB表型。而由mefE基因型编码主动外排系统介导的耐药，只对14、15环大环内酯类耐药，对16环大环内酯类，林可霉素类、链阳菌素B敏感。北美以mefE基因介导的耐药表型较为常见。而在西班牙和意大利，最为常见的耐药表型为MLSB。核糖体突变（erm基因编码）是国内肺炎链球菌耐红霉素的主要机制，与欧洲地区的结果相似[16、17]。
北京、上海、广州和西安等地儿童进行的流感嗜血杆菌携带和耐药性调查表明，氨苄西林的耐药率处于较低水平（4﹒8%~9﹒7%）。头孢克洛的耐药率（1﹒9%）低于氯毒素耐药率（5﹒7%~11﹒5）[18]。上海地区2000-2002年964株流感嗜血杆菌中[19]，β内酰胺酶阳性有增长趋势（2000年为13﹒0%、2001年为17﹒2%、2000年为20﹒0%）。虽然对临床单纯流感嗜血杆菌的感染氨苄西林具有很好的疗效，但该菌的耐药性发展趋势值得注意。
　　（四） 产超广谱β内酰胺酶扩AmpC酶的革兰阴性杆菌
　　1 我国各地区及医院产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离不同，一般在15%~35%左右[20]。不同国家和地区由于抗生素使用的种类和数量的不同，与之相应的ESBLs流行类型也不同。德国的主要流行类型为SHV-2和TEM-52，法国为TEM-24、TEM-3和SHV-4，美国主要为TEM-2、10和26，亚洲韩国为SHV-12、SHV-2a和TEM-52，我国台湾省主要为CTX-M-3、SHV-12和SHV-5。
　　CTX-M型ESBLs产酶株的菌谱及地域分布极为广泛，是导致某些地区ESBLs产酶株传播或流行的主要基因型。国内医院感染ESBLs产酶株的分子流行病学研究表明，CTX-M型酶最为常见的基因型。CTX-M对头孢噻肟具有高水解活性，而对头孢他啶水解力弱，为等电点（pI）高的ESBLs。朱戌冬等[21]对80株肺炎克雷伯菌临床株进行了ESBLs检测、pI试验和分子遗传学的酶型分析，发现了一种CTM-M酶。鉴定为CTX-M-3′，pI为8﹒8，对头孢他啶活性仅为MIC2ug/ml。我国ESBL主要为CTX-M，与我国头孢噻肟的用量多于其他三代头孢菌素有关。北京协和医院1995-1999年，头孢噻肝的用量从19㎏增加到102㎏，而头孢他啶仅从9㎏增加到15㎏，可以推测产CTX-M的ESBL菌株的出现与此有关[22]。魏泽庆等[23]对6株临床分离的肺炎克雷伯菌进行浓度梯度法药敏试验、结合试验、β内酰胺酶等电聚焦电泳、脉冲场凝胶电泳及PCR产物克隆测序，鉴定为一种新型CTX-M-22酶。陆坚等[24]在378株革兰阴性菌中，产ESBLs菌株为64株。其中产CTX-M-3酶的有13株，占20%。CTX-M-3、CTX-M-9、CTX-，-15、CTX-M-17和CTX-M-21型酶定位在1型整合子或转痤子等可转移基因元件上，并可能通过转座子介导在不同细菌间播散[25]。
　　SHV起源的ESBLs主要位于肺炎克雷伯菌，其突变位点主要在238、240、179及35等。其中238位点的突变提高了酶对头孢噻肟的水解，而240的突变提高了酶对头孢他啶的水解力。临床携带SHV型ESBLs菌株有的对头孢噻肟耐药较强（SHV-2、3），有的对头孢他啶耐药较强（SHV-6、8），有的两者均耐药（SHV-4、5）。文献报道4株产SHV-12的肺炎克雷伯菌，其耐药表型为头孢他啶耐药，对头孢噻肟或耐药或中介[26]。
　　上述研究表明，国内临床分离菌中所产生β内酰胺的复杂性和多样性，同时也可能是导致临床菌株耐药水平高、耐药谱扩大的原因之一。
　　2 　AmpC酶：通常认为，阴沟肠杆菌对三代头孢菌素的碉药主要是由高产AmpC酶介导，由ESBL介导的耐药居于次要的地位。佘丹阳等[27]在106株阴沟肠杆菌中发现，单纯高产AmpC酶占16﹒0%（17/106），单纯产ESBL占10﹒4%（11/106），高产AmpC酶全并产ESBL的占13﹒2%（14/106）。因此，高产AmpC酶和产ESBL介导的耐药几乎处于同样重要的意义[28]。野生状态下，大多数阴沟肠杆菌只能诱导性产生AmpC酶，ampD基因的突变可以使细菌获持续高产AmpC酶的能力。在阴沟肠杆菌中，这种去阻遏突变的发生频率高达10-5~10-8，β内酰胺类抗生素对这种去阻遏突变的选择作用是导致高产AmpC酶菌株迅速蔓延的主要原因之一。
　　由于检测方法的不同，各地区对产AmpC酶的阴沟杆菌报道不同。有文献[29]在144株阴沟肠杆菌中检出有120株AmpC基因阳性（83﹒3%）。在120株AmpC基因阳性菌株中，36株为高水平表达（30﹒0），诱导表达为45株（37﹒5%），未表达或低水平表达39株（32﹒5%）。有56株合并产生ESBLs，占46﹒7%。AmpC酶是染色体介导的头孢菌素酶，通常情况下，这种酶低水平表达，但在β内酰胺抗生素存在的情况下，酶量会大大增加，因此又称诱导酶，细菌产AmpC酶的量常与细菌种类及ampG。大部分肠菌科细菌均存在染色体介导的ampD基因，且在肠杆菌科细菌中具有高度同源性。
　　细菌耐药性的演化大致可分为自身遗传物质的突变和接受外源性耐药基因两种。肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌均具有容纳外源性遗传物质的特性，作为医院感染重要的病原菌，继ESBL后又出现质粒介导的AmpC型酶，使耐药问题日益复杂。北京协和医院[30]在16株产AmpC酶的大肠埃菌和肺炎克雷伯菌中，发现1株可通过接合试验将耐药基因传递给受体菌，这是国内首次报道的在大肠埃菌中发现质粒型AmpC酶。NCCLS尚未提供AmpC酶的检测方法，临床实验室通常根据耐药表型（二、三代头孢菌素耐药、双纸片协同试验阴性、对四代头孢菌素敏感）综合判断。药敏试验中需包含头霉素类和含酶抑制剂的复合制剂是许多学者的共识。
　　3 碳青霉烯酶：是指所有明显水解亚胺培南或美洛培南等碳青霉烯类的一类β内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。其中B类为金属酶，在Bush分群中为第三组，可由染色体、质粒或转座子介导，由后者编码的获得性金属酶可见于绿脓假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肠杆菌科细菌；A类和D类为丝氨酯酶，属于Bush分群中的2f和2d亚组。A类酶见于一些肠杆菌科细菌，D类酶仅见于不动杆菌。常见的金属酶基因型有IMP、VIM、LI等，其酶的检测方法一般采用PCR方法，由于早期报道的PCR引物序列发现的基因型别较少，但应根据新发现的型别调整PCR引物序列，并对PCR引物进行测序方可确认亚型型别[31]。
　　纸片检测产酶株方法：菌株粗酶提取物，用三维试验法进行酶型检测。以产AmpC酶和ESBL（如ATCC 700603）菌株作为阳性对照。抑制剂为克拉维酸、邻氯西林和EDTA。抑制剂与酶粗提取物以1：9比例混合加入三维试验的槽内，经35℃24h培养后，观察结果。若加抑制剂槽的周围矢状菌苔消失，即为抑制试验为阳性，即该菌产AmpC酶。若克拉给维酸试验为阳性，即该菌产ESBL；若邻氯西林单独加入时抑酶试验为阳性，反之为阴性，即该菌产AmpC酶。若克拉维酸或邻氯西林单独加入时抑酶试验为阴性，同时加入为阳性时，这说明该菌同时产AmpC酶和ESBL两种酶，当同时加入克拉维酸和邻氯西林抑酶试验仍为阴性，该菌可能产生耐抑制剂的β内酰胺酶，若能水解亚胺培南且可被EDTA所抑制即为金属β内酰胺酶[32]。纸片法检测金属β内酰胺酶的产生[33]：将500mmol/L EDTA 10ul分别加到头孢他啶和亚胺培南纸片上，按纸片扩散法检测菌株头孢他啶、头孢他啶/EDTA、亚胺培南，亚胺培南/EDTA的抑菌环直径，EDTA能使相应抗菌药物的抑菌环直径扩大为≥5mm者，判为金属β内酰胺酶阳性，瑞典AB Biodisk公司生产的金属β内酰胺酶的E试条为亚胺培南和亚胺培南+EDTA，将E试条贴在涂有受试菌的MH琼脂上，经35℃18h培养后，分别判读亚胺培南和亚胺培南+EDTA各自的MIC值，其比值≥8，判定为金属β内酰胺酶阳性。该试条的敏感性和特异性分别达94%和95%[34]。
　　（五）、非发酵菌
　　非发酵菌在临床分离菌株的比例逐年增多，上海地区监测结果[35]显示，非发酵菌从1991年的25.6%到2001年的34.8%，其中嗜麦芽窄食胞菌从1993年的0.99%到2001年的11.07%。这一变迁可能与临床上多种广谱抗生素尤其是第三代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素广泛使用有关。
　　据医院感染危险因素及预后因素分析显示，高龄，入住重症监护病房、有支气管扩张基础病、医院获得性肺炎、分离致病绿脓假单胞菌前15d接受氟喹诺酮和碳青霉烯类抗生素治疗等因素均易导致绿脓假单胞菌多重耐药。多因素分析发现，分离致病绿脓假单胞菌前15d接受碳青霉烯类抗生素治疗是产生绿脓假单胞菌多重耐药的独立危险因素[36]。抗生素使用与产生耐药株的关系，其危险系数依次为：亚胺培南44，环丙沙星9.2、哌拉西林5.2。
　　鲍曼不动杆菌是引起医院感染的重要病原菌，它对多种抗菌药物耐药，亚胺培南对不动杆菌有较好的抗菌活性，往往是鲍曼不动杆菌医院感染的首选药物。但随着亚胺培南在临床的广泛应用，对亚胺培南耐药的不动杆菌有增多的趋势[37]。
　　嗜麦芽窄食单胞菌感染多发生在机体免疫受损，肿瘤患者以及器官移植患者中。不合理使用广谱抗生素、有创伤性治疗，均是该菌感染发生率增加的因素。嗜麦芽窄食单胞菌的纸片法药敏试验在2004版NCCLS[6]标准中有部分抗菌药物的标准，并推荐培养时间为20~24h。

摘自：《中华检验医学杂志》2005年4月第28卷第4期