沈霞 沈立松

　　近年来，随着蛋白质多肽纯化技术的日臻完善，单克隆抗体技术日趋完美，分子生物学技术的迅速发展及其与免疫学的结合，推动了细胞免疫功能和细胞因子研究的进程，大量新的细胞表面标志和细胞因子不断自身免疫性疾病、免疫缺陷病、肿瘤患者治疗前后细胞免疫功能的检测，骨髓移植和器官移植过程中的免疫功能监护，感染性疾病和变态反应怕疾病的免疫功能监测，以及揭示一些疾病的民病机理等方面，因而促使这些疾病的研究和防治提高到了一个新的阶段[1，2]。
　　一、 细胞免疫功能和细胞因子检测现状
　　细胞免疫功能和细胞因子的核心是T细胞及其亚群，同时自然杀伤细胞（NK）及NKT细胞也同样发挥重要作用。迄今为止，与细胞免疫功能相关的实验诊断主要围绕机体细胞免疫功能状态进行评估，如淋巴细胞数量的变化（百分比及绝对数计数）。由于条件限制。 国内开展细胞免疫功能相关测试的单位不多，主要在三级医院进行，经典的玫瑰花环试验等项目基本淘汰或只在小型医院开展。随着流式细胞术的普及，很大程度上提高了细胞免疫相关工作的水平，并且很快地进入到为临床提供诊治依据阶段。目前，国内常规开展的工作包括：淋巴细胞及亚群表面标志[如白细胞分化抗原（CD）3、CD4和CD8]、NK细胞表面标志（CD16/CD56等）、淋巴细胞绝对数计数和淋巴细胞活化标志物检测（如CD25和HLA-DR等）有此单位还开展了胞浆内标志物检测，如用于扰素（IFN-γ）和白细胞介素（IL-4）分析Th1/Th2细胞等。
　　当前，细胞因子生物学进展主要为三个方面即配体和受全三维结构的确定，胞内信号传导途径的阐明及用分子遗传学手段确认新的细胞因子。迄今发现的细胞因子已有百余种，如：从IL-1发展IL-30，其中IL-1又分为IL-1α和IL-1β两种。IFN有α、β和γ三种。集落刺激因子（CSFs）包括粒细胞（G-CSF）、单核细胞（M-CSF）、巨核细胞集落刺激因子（MEG-CSF）、红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）等。干细胞集落因子（γ-SCF）、肿瘤坏死因子（TNF）、生长因子[（growth factor）包括生长转化因子（TGF-β）纤维细胞生长因子（FTF）、表皮生长因子（EGF）、肝细胞生长因子（HGF），神经生长因子（NGF），血小板衍生的生长因子（PDGF）]和趋势化性细胞因子等[3]。此外，细胞因子的命名较混乱，除因若干不同的细胞因子可显示相似的功能外，还与细胞因子在一个复杂的网落中行使功能时，可影响若干其他细胞因子的产生，或影响其对其功能性成员，TNFα家族则包含有30种细胞因子。而基因组分析已预测出趋化性细胞因子家族有50种以上不同的解质。再加之这此眼花缭乱的细胞因子的相互诱生、相对调节、相互间叠加及协同或抵抗作用，所构成交颉的细胞因子网落（cytokine network），因而使有经验的研究人员也感到震惊[4，5]。
　　对细胞因子的检测主要采用生物活性测定法，生物活性的指示细胞最好用细胞株，尤其是依赖性细胞株细胞，这样可使特异性和灵敏度明显优于生物素与亲和素放大系统，这可极大地提高检测的灵敏度，即已接近生理浓度（1ng/L），可测到5~10ng/L，并达到放射免疫法的灵敏度。该法的优点是特异性高，操作方便，很适合临床应用。其缺点为，提供的是免疫活性信息，而不是细胞因子生物活性信息。
　　在采用ELISA检测细胞因子时，应熟悉所测细胞因子的性质和其存在的形式与部位，正确选择测标本及收集的时间，并注意防止污染和减少干扰，才能获得满意的结果。如（1）采用泫式细胞术测定特定细胞胞浆（外周血CD4+的Th细胞胞浆）中的细胞因子（IFN-γ和IL-4），检测用的抗体组合为CD69-PE/CD4-PerCP和IFN-γ-FITC/IL-4-PE/CD4-PerCP。（2）CD69为活化最早期的指标，应用CD69-PE/CD4-PerCP测CD4+T细胞中表达IFN-γ和IL-4的细胞的比例。（3）我们认为，在检测过程中，经BrefeldinA处理后CD4表达降低，抗体组合中用CD4来界定CD4+细胞会造成较大的偏差。因此，采用CD8-/CD3+来界定CD4+T细胞，所用的抗体组合是IFN-γ-FITC/IL-4-PE/CD3-PerCP/CD8-APC，才能取得更好的效果。
　　二、 细胞免疫和细胞因子检测中较常见的质量问题
　　长期以来，细胞免疫和细胞因子相关检测的质量控制存在较大的缺陷，主要表现在以下几个方面。
　　1． 忽视了流式细胞仪的正确使用的校准：流式细胞术操作技术性要求较高，检测结果受主观影响较大，操作人员需经长期的正规培训后才能上岗，国内有些单位在引进流式细胞仪时，往往忽略了人才的培养，使得仪器的使用停留在低水平状态，而影响工作的开展，有些单位的流式细胞仪每次使用前不进行荧光检测器的校正，即检测标本，因而结果的准确性备受质疑。
　　2． 流式细胞术室内质控工作不常规化和规范化：室内质控工作中的主要问题是很多实验室没有重视这一问题，加是质控品的销售渠道受限制，使得国内流式细胞术的室内质控工作基本陷于空白状态，这是今后需要大力改善之处。
　　3 ．流式细胞术的室间质控工作起步晚：流式细胞术的室间质评工作在国内则刚刚起步，卫生部临检中心于2000年开始，将流式细胞术列入室间质评计划。该计划有两项工作：淋巴细胞及其亚群检测，包括T细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、B细胞和NK细胞；CD34阳性细胞计数。2003年国内有56家实验室参加此项计划，上海和北京等地区的医院还同时参加者了一些国际性的室间质评计划，如加拿大国际质量评估体系（QASI）计划和澳大利亚皇家病理医师协肝质量评估体系计划（RCPA QAP），在这些技术管理活动中，各医院的流式细胞术的检测质量得到了有效的提高。
　　4 ．存在生物活性法测定细胞因子间的干扰：由于采用生物活性测定细胞因子时，细胞因子间有干扰依赖性细胞株细胞的特异性又并非绝对，所以，特异性差成为生物活性测定法普遍的缺点。
　　5． 标本采集质量不高：通常血液中细胞因子的浓度很胝，体液和细胞培养的标本留取又有一定的难度，一些实验室对所测细胞因子的性质和其存在的形式与部位不清楚，对如何正确选择待测标本及其收集的时间又不严格，往往使试验污染导致结果的正确性受干扰。
总而言之，与细胞免疫有关的检测工作在国内属于一个快速发展的领域，国内同行应高度重视其质量管理和规范化操作问题，以提高检测的准确性。
　　三、 细胞免疫检测未来的趋势
　　随着基础免疫学理论及技术的飞跃发展和检测技术的不断成熟，使得细胞免疫领域的新成果快速应用于临床成为现实。未来细胞免疫学检测在临床医学的应用领域主要有以下几个方面：器官移植免疫学、肿瘤免疫学、超敏反应、自身免疫、先天性及获得性免疫缺陷等。具体的检测指标及方法则可能有下列形式。
　　1． 疾病诊断中的新指标：随着基础研究工作的不断深入，细胞免疫功能机制将被越来越多的运用到疾病的诊断中。（1）在T细胞的活化过程中，除需要抗原递呈细胞加式处理的抗原片段外，还必须有第二个活化信号，因而有关第二活化信号传递，如CD28-B7或活化抑制相关配体PD-1有关检测将在阐明某些疾病民病机制中发挥重要作用。（2）针对病原微生物特异性反应T细胞的检测，将有助于机体免疫功能和感染状态的评估。（3）肿瘤反应性T细胞的检测和调节性T细胞表型鉴定和其功能相关性细胞因子的检测，将在肿瘤发病机制、治疗效果和预后评估等起一定的指导作用。（4）树突状细胞（DC）的检测；NK细胞及NKT细胞检测，如NK细胞活化或抑制性受体检测等也将成为细胞免疫功能中重要的临床应用领域。
　　2 ．免疫治疗的应用：在医学技术飞速发展的今天，细胞免疫相关功能的检测也将在免疫治疗中发挥重要的辅助诊断作用。在肿瘤疫苗使用过程中，需对DC活化进行监控；活化T细胞的检测，如CTLA-4、CD25、GITR等指标将成为未来细胞免疫工作的方向之一。器官移植（包括骨髓移植）中免疫功能的监控是移植成功的关键，特别是免疫抑制剂的使用过程中，必须开展细胞免疫功能的监测，以防止排斥反应或移植物抗宿主病（GVHD）。另外，在自身免疫性疾病治疗中，可进行淋巴细胞黏附及移动因子的检测，以及与自身抗原递呈有关的分子检测和自身反应性T细胞的鉴定等。
　　3 ．微珠阵列细胞分析（CBA）的应用：CBA分析是建立于一系列光谱分散的、大小均一的微粒在流式细胞术中产生不同荧光颜色的基础上的方法，该方法可同时检测一份标本中包括细胞因子在内的不同可溶性分析物。一般这种不同荧光强度的微粒可以同时检测6种细胞因子（IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-5和IL-10等），与ELISA法相比，其省时，使用标本量更少，即可达到相似的敏感性（pg/ml）和重复性，而且，通过测定同一份样本中6种细胞因子浓度，还可计算出细胞因子的比率。此比率可作为不同疾病状态的标志，如哮喘，变应性疾病和系统性红斑狼疮。然而，对个体而言，不同细胞因子间的平衡通常比细胞因子的绝对浓度更重要[6]。
　　4 ．细胞因子基因表达定量分析：传统的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）只能用于提供标本中细胞因子基因表达半定量分析。近年来，Perkin-Elmer公司开发了实时测定的Taq-Man细胞因子基因表达板，可进行荧光定量系列人细胞因子基因表达检测。
　　5 ．多基因表达分析：人类基因组计划大规模测序获得了数万种基因的完全序列，而明确细胞因子基因表达是解释细胞因子在不同生物过程中作用的重要步骤。完全cDNA与核酸阵列的杂交（包括玻璃阵列或膜阵列）已被用来进行多基因表达的高通量分析。cDNA微阵列将成千上万基因固定在玻璃或其他基质上，与预期的荧光素标记cDAN样本杂交后，应用高通量荧光技术可快速分析数千基因的序列和多态性，由于玻璃阵列的密度和灵活性好，它已成为进行细胞因子研究的技术。最近，已经有在极化的Th1和Th2细胞中细胞因子、受体及其他信号分子的差异表达报道。
　　综上所述，随着细胞免疫有关的检测工作在国内的快速发展，定将使其在肿瘤，自身免疫性疾病和器官移植等诸多领域发挥越来越重要的作用。

摘自：《中华检验医学杂志》2005年第28卷第2期