王鸿利

　　近年，随着基础医学、临床医学和实验技术的进展，止血与止血检验出出现了许多新的研究热点和新的发展趋势。
　　1． 由一般的筛选检验到新颖的检验诊断：由于血栓与止血的诊断须以有效实验为依据，因此，不断建立血栓与止血方法是提高血栓与止血诊断准确性的重要措施。我国在20世纪80年代以前，开展和应用的血栓与止血检验仅限于一般的筛选试验，如白陶土部分凝血活酶时间（KPTT）、血浆凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白帮定量测定（Fg）、凝血酶时间（TT）和硫酸鱼精蛋白副凝固试验（3P试验）等。20世纪80年代至今，逐年建立或更新了许多新的检验诊断项目，并已应用于临床，如血小板聚集试验（PAgT）β-血小板球蛋白（β-TG）和血小板第4因子（PF4）测定、血小板P-选择素（GMP-140）测定。凝血因子VⅢ和Ⅸ促凝活性（FⅧ：C、FⅨ：C）及其抗原含量（FⅧ：Ag、FⅨ：Ag）测定、凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）测定等[1]。近处，又有一大批更新的检测方法问世，如血小板微颗粒（PMP）检测血小板-白细胞聚集体测定（PLAg）、可溶性血管内皮细胞蛋白C受体测定（Sepcr）、可溶性尿激酶受体（su-PAR）测定、凝血酶激活的纤溶抑制物测定（TAFI）、蛋白C Global试验、蛋白Z抗原测定（PZ）和血管性血友病因子裂解蛋白酶活性测定（vWF-cp）等[2]。
　　2． 由手工法检测到自动化仪器检测[3]：以前，几乎所有的凝血检验（KPTT、PT、TT和Fg等）都采用手工法。众所周知，手工法存在着许多固有的缺点和难以避免的干扰因素，其检测结果的准确性和可信度较低。20世纪90年代以来，国外许多先进的血栓与止血的检测仪器涌入我国市场，大大地推动了我国血栓与止血检验诊断研究的发展和提高，例如，全（半）自动血液凝固分析仪、血浆（全血）血小板聚集仪、血小板功能分析仪、血液流变分析仪以及流式细胞仪等。这些仪器的共同特点是：（1）自动化：在同一仪器中，包括标本的自动识别、自动接受、自动离心、自动放置、自动检测；检测结果的自动记录、自动分析、自动报告，随后标本又可自动拆卸、仪器自动清洗等。（2）多功能：同一仪器中，可以采取物理化学、生物学、免疫学、干化学技术和超声分析等方法进行检测。（3）智能化：由于仪器具有多功能，故可自动打印和报告多项参数，仪器对所测项目达到任意检测（walkway assay）的要求，同时仪器设有质量控制（QA）系统，可以确保检测结果的准确度。（4）可靠性：检测结果的可靠性体现在精密度（precision）和准确度（accurary）上，如自动血液凝固分析仪的批内CV值可低于3%，批间CV值中低于8%。
　　此外，由于各种自动化仪器者匹配了各种相应的高质量的试剂，因此，可以根据检测目的的不同，选用所需要的试剂。选择试剂的原则是：（1）按检测的重复性和灵敏度选择合理的试剂；（2）按仪器的性能不同选择匹配的试剂；（3）使用商品试剂必须严格遵循试剂说明书，然而，在行动化仪器上，使用商品化试剂，必须采用国际标准化、精密度高、准确度好的检测方法，这样才能得到理想的检测结果。
　　3． 由检测试验的终点到检测试验的功能：众所周知，血液凝固的过程和纤维蛋白溶解过程都是动态发展的过程。例如，临床所用的传统的活化部分凝血活酶时间（APTT）是在受检血浆中加入部分活酶试剂，以纤维蛋白形成为终点，记录血浆凝固所需的时间，它检没的只是血浆凝固终点这一单个的信息，但是它不能反映内源凝血系统血液凝固的动态演变过程，近年，法国梅里埃（bioMerieux）公司研制的MDA血液凝固分析仪[4]可以用以检测双相活化部分凝血活酶时间（biphasic APTT）。该仪器是联合应用光度计和分析软件记录血液凝固全过程的浊度变化，并且绘制出血液凝固过程中光率的波形变化图像，可以提供从凝血因子被激活到纤维蛋白聚集形成之前的凝血时间、凝血速度和凝血加速度等变化的多种量化信息，以了解血液凝固全过程的动态变化。该仪器检测正常人APTT图形呈“乙”字形，其血浆凝固之前波形平坦，用以检测疑诊DIC患者，可以出现异常的凝血透射波形，其血浆凝固之前，坡度呈现下降曲线[4]。从波形图可以看出，虽然正常人和DIC患者在APTT检测的时间上没有太大的区别，但是DIC时，患才体内形成Ca2+依赖的极低密度脂蛋白（VLDL）和C反应蛋白（CRP）的复合物，后者导致透光度的改变，应用双相APTT可以得到这一信息。Downey等[4]对747例患者用双相APTT诊断DIC。其灵敏度为97。6%，特异性为98。0%，阳性预测值为74。0%，阴性预测值为99。9%，且在DIC出现之前18h即可改变，可准确诊断DIC前期（pre-DIC），是一种较理想的检测方法。
　　4．  由检验的简单评估到系统评估：以往对一项检验的评估，仅能指出检验操作过程中注意事项，当今对建立和使用的检测诊断应作系统的评估（systematic review，SR），其目的是对检验的准确性得出全面、真实和可靠的科学结论。系统评估应包括：（1）对所建立和使用检验的技术质量评估：指待评估检验与参考方法或“金标准”方法作出比较，得出检验的灵敏度（Sen）、重复性、阳性似然比（+LR）、阴性似然比（-LR）等。（2）对所建立和使用检验诊断的准确度评估：指待评估检验与诊断疾病的“金标准”（如病理组织学检查）作出比较。得出的检验诊断的灵敏度、特异性、准确度（Acc）、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）等，目前，对检验技术质量有所重视，但对检验诊断准确度和评估尚需加强[5]。
　　国内颜存粮和彭黎明[6]对DIC检验诊断作了系统评估：（1）常用检验指标的评估：包括血小板计数（PLT）、Fg、PT、APTT和3P试验的灵敏度（Sen）依次为82.7%、38%、75.6%、68.5%、37.2%;特异性(Spe)依次为43.9%、77.0%、58.3%、65.8%、85.7%;诊断准确度(Acc)依次为59.5%、60.2%、65.0%、99.6%、65.9%;综合比数比(OR)依次为4.39、2.28、7.89、4.66、4.71.由此可见,常用实验指标对诊断DIC的价值较低.(2)诊断实验指标的评估:包括可溶性纤维蛋白单体复合物(SFM) 、AT、FDP、D-D、TAT和PAP的Sen依次为87.1%、83.0%、91.8%、80.4%、75.4%、63.8%;Spe依次为84.2%、48.5%63.7%、70.6%、69.7%、73.4%;Acc依次为85.8%、65.9%、75.4%、75.1%、73.0%;OR依次为34.24、6.90、18.2、15.56、8.86、4.86(非综合OR).由此可见,这些检验指标对DIC的诊断价值较高.随着系统评估的普及及深入,无疑将对血栓与止血的检验诊断、治疗和预后具有重要的指导意义.
　　5.由单项检验应用到优化组合作用:临床上见到以出血为主要表面的患者,以前多检测出血时间(BT) 、血小板计数(PLT)或APTT、PT等单项试验作诊断依据,常会造成漏诊可误码诊,目前主张以循证实验医学(evidence-based laboratory medicin,EBLM)的”以当前最佳证据”为原则,指导实验诊断的优化组合应用,为临床决策提供有效的实验证据.例如,对遗传性凝血因子缺陷性患者,须以临床出血表现为基础,选用APTT和PT为筛选试验,因子促凝活性(F:C)和因子抗原含量(F:Ag)测定为诊断试验,它们构成一组优化组合试验.检测结果可有下列4种情况[4]:⑴APTT和PT都正常:除正常人外,仅见遗传性因子Ⅷ缺陷症,再用因子Ⅷ定性检验或因子Ⅻ活性测定加以确诊;(2)APTT延长,PT正常:多数是由内源凝血途径缺陷所致出血病,如遗传性因子Ⅷ(血友病A) 、因子Ⅸ(血友病B)和因子Ⅺ缺陷症,再用相应因子的促凝活性(FⅧ:C、FⅨ:C、FⅪ:C)和因子抗原含量(FⅧ:Ag、FⅨ:Ag、FⅪ:Ag)测定加以确诊;(3)APTT正常,PT延长:多数由外源凝血途径缺陷所引起的出血病,如遗传性因子Ⅶ缺陷症,再用因子Ⅶ促凝活性(FⅦ:C)和抗原含量(FⅦ:Ag)测定加以确诊;(4)APTT和PT都延长:多数见于遗传因子X、V、凝血酶原(FⅡ)T 纤维蛋白原(Fg)缺陷症,再用相应因子的促凝活性(FX:C、FV:C、FⅡ:C、Fg定量)和抗原含量(FX:Ag、FV:Ag、FⅡ:Ag)测定加以确诊.然后通过家系调查和家系成员的检测,可以得出完整而准确的诊断,避免无目的的乱开检验单和造成不必要的资源浪费.
　　6.由单个基因突变分析到基因芯片分析[8]:基因突变(gene mutation)是指基因组(genome)DNA分子在结构上发生碱基对的组成或排列顺序的改变,即可导致个体表型的异常或疾病,目前常用的检测方法是.(1)点突变分析(point mutation):常用限制隆片段长度多态性(RFLP) 、单链构象多态性(SSCP) 、变性梯度凝胶电泳(DGGE) 、等位基因特异寡核苷酸(ASO) 、毛细管电泳(CE)和基因(DNA)测序等方法诊断.(2)基因连锁分析:在人群中,个休璋基因的寡核苷酸序列存在着差异性,称为基因(DNA)多态性;在特定对象中,若某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁,就可用这一多态性片段作为“遗传标志”来判断家族成员或胎儿基因中是否携带致病基因.最后确定是否存在与疾病平衡传递的关系.(3)mRNA分析:通过聚合酶链反应(PCR)检测.可以直接从总的PCR(real time PCR)出应用于mRNA的检测.(4)DNA序列分析:直接测定某一特定DNA的碱基对,现已用自动测序仪,其检测结果对确定基因突变的部位和性质有决定性的意义.
　　目前,芯片技术的发展迅猛,其中基因芯片(gene chips)通常指DNA芯片,它是一种以微型化、集约化和标准化为特征的实时、灵敏和准确检测基因的新技术.主要有以下类型:(寡核苷酸微阵列(oligonucleotide array):采用照相平板印刷技术结合引导原位寡核苷酸合成技术制作而成,可以达到1×106/cm2和微探针排列密度,能在1cm2的片基上排列几百万个寡核苷酸探针.(2)微电子芯片:多位点电控阵列并含独立可检测区域的微电子基因芯片,含25~400个微泊位点,各位点可由计算机独立可组合控制,可准确的进行单核苷酸多态性检测.(3)微量点样技术:采用了更加微量的点样技术.可以点加微量探针,这种芯片上探针不受探针分子大小和种类的限制,是目前最多用的一种方法.(4)毛细管微电泵芯片:在边长2英寸和芯片上集成144为微室,可用于基因诊断和分析等.
　　综上所述.在高科技迅猛发展的今天,上述无颖是血栓与止血检验诊断的研究的热点及发展趋势,我们还应结合临床实际,不断探索更灵敏、准确、便捷和经济和诊断方法,不断提高血栓与止血的实验室诊断水平.

摘自:《中华检验医学杂志》2005年1月第28卷第1期