成军

　　乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性肝脏疾病仍然是我国主要的传染病，1979年首次完成HBV DNA的克隆化之后，随着对更多的HBV DNA全基因或基因片段的克隆和序列分析，发现不同患者感染的HBV DNA序列存在差别，而且不同基因序列的HBV感染机体后产生的抗体应答的性质也存在显著的差别，因此，根据HBV感染之后抗体应答性质的差别。将HBV分成不同的血清型（serotype）；根据HBV DNA基因序列的不同，将HBV分成不同的基因型（genotype）。临床研究结果表明，不同血清型和基因型的HBV感染的流行病学特点、临床表现、预后、抗病毒治疗的应答等存在显著的不同。这仅仅是认识到不同患者感染的HBV存在异质性（heterogeneity），但是对同一患者血清中存在的不同拷贝的HBV的基因序列究竟是否存在差别及其意义如何，一直没有引起人们的广泛重视。实际上，每一个患者血清中都存在大量拷贝的HBV，每一拷贝的HBV DNA序列不尽相同，表面也准种（quasispecies）的特点[1，2]。
　　一、乙型肝炎病毒的准种的概念
　　准种的概念是从噬菌体的研究开始的。随后与临床疾病有关的一些重要的RNA病毒准种特点的研究也得到了充分的认识和重视。如人免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）的准种特点的认识已相当深入。但是，HBV是否存在准种的特点，一直没有明确的结论。我们通过大量实验。近年不发现HBV具有准种的特点，且对于HBV的准种进行了系统的研究[3-13]。我们首先从慢性HBV感染的患者血清中扩增中国内地流行的adr、adw亚型的HBsAg的编码基因。从1例患者血清标本中得到的30个克隆，发现各个序列之间具有遗传学上的高度相关性，但又不完全相同。这此基因序列来源于同一个患者，同属于一个基因型和血清型，但是每个克隆之间又存在着差别，为了描述这种差别。采用了研究RNA病毒基因序列判别的种群概念，即准种的概念。准种的概念强调的是遗传学特点的高度相关又不有不同，同时在自身和外界因素的影响下优势和劣势种群的构成又处于不断变化之中，对不同HBV基因区和不同患者进行研究。都得到相同的结论。因此，准咱特点是HBV存在状态的一个普遍的规律。准种概念的提出，不是对HBV存在状态的一种简单的描述，而是使人们在HBV存在状态的认识方面产生了两次重要的飞跃。准种概念强调的是同一患者血清中不同拷贝病毒之间的遗传相似性、微小差别、病毒群和动态变化等四个要素，对HBV存在状态的认识产生了从单一病毒到病毒群、从静态到动态变化的两次飞跃。
　　二、 肝炎病毒的准种特点的意义
　　HBV准种概念的内涵尽管简单，然而关于HBV存在状态的准种特点认识的意义却很重要[14-17]。准种概念的引入彻底的改变了人们对HBV存在状态的看法，是对HBV存在状态认识的一场革命。首先，引入准种的概念，人们对于HBV DNA全基因序列的认识就深入一步。在美国生物工作信息学中心（NCBI）建立的核苷酸序列数据库GenBank中注册的HBV DNA全基因序列，绝大部分都是应用聚合酶链反应（PCR）技术进行分段扩增、克隆，然后再进行人工拼接，形成了所谓的HBV DNA全基因序列。如果从准种特点来就，这些基因序列根本不代表任何真正存在的病毒的基因序列，是来源于不同的病毒基因组基因片段的嵌合体，完全是一种人为拼接序列。第二，引入准种的概念，对于抗HBV疗效考核及其对于HBV的影响研究方法就要做出相应的调整。在进行抗病毒的治疗的临床研究中，在抗病毒治疗前后仅克隆少数甚至是单一的HBV DAN片段的序列，进行比较发现不同之后就判定抗病毒治疗对于HBV基因序列的影响，这样的结论是完全靠不住的。第三，引入准种的概念，使医学界对于抗病毒治疗的艰巨性和复杂性有了一个全新人认识。因为慢性乙型肝炎患者血清中HBV具有多样性，不同的病毒对于不同的抗病毒药物的敏感性完全不同。这样就不奇怪一种抗病毒药物治疗的效果极其有限的事实了。第四，能上能下入准种的概念，使检验医学界意识到对于目前的检测手段进行审慎选择和改进的必要性。随着特异性检测技术的应用和抗病毒药物的应用，以及重组疫苗的广泛应用，HBV的生存和传播的环境条件已经大大改变。HBV种群已经发生了相当大的改变，而且这种改变还在继续进行下去。以准种的眼光重新审视HBV的存在状态和特点，未雨绸缪，必须着手设计新型的检测方法和治疗药物。第五，引入准种的概念，预防医学对于免疫预防的任务艰巨性有了深刻的了解。将来的免疫预防主要对象不是目前广泛存在的野生型病毒，而是发生了明显变异的病毒株。这样根据主要流生野生型病毒设计疫苗免疫预防效果就会有显著降低，为了应付将来出现的免疫预防的新局面，必须以准种的观点来看待乙型肝炎免疫预防的课题，才不至于将来有一天措手不及。从目前免疫预防失败的儿童血清中检出的HBV基因序列已经发生了显著变异的事实来看，也非常支持这一观点。
　　三、乙型肝炎病毒准种特点到HBV实验室诊断
　　HBV基因突变与HBV感染实验诊断结果的判定密切相关。HBV表面抗原某些重要位点的突变。导致HBsAg抗原性发生改变，从而使得目前的HBsAg检测结果产生一定的偏差。其实，HBV准种特点对于HBV感染实验室诊断的影响不仅仅限于HBsAg编码基因区，对于其它基因区的编码产物抗原性都有显著影响。因此。随着HBV DNA基因序列的不断变化，HBV生存环境的进一步变化，HBV DNA序列变异对于HBV感染实验室诊断具有显著的影响。
　　从抗病毒治疗这一角度来看，不同病毒对于抗病毒药物的敏感性不，因此必须根据病毒准种种群的性质来确定个性化治疗方案。就像对于怀疑细菌感染的患者要进行细菌培养、体外药敏试验。然后根据体外药敏试验的结果，选择合适的抗生素和治疗方案。这是细菌感染临床治疗的一般原则和做法。但是，HBV感染者的抗病毒治疗，虽然人们认识到病毒的不均一性对病毒治疗效果有显著影响，但人们从来没有进行系统检测每个HBV感染者的病毒基因序列的差别。更没有把这种HBV基因序列的不均一性和对于抗病毒治疗物敏感性的不同考虑到治疗方案中来。如果只有青霉素，可以不进行体外药敏试验，因为必须先进行体外药敏试验，来指导抗细菌化疗的临床实践，十分必要而且可行。HBV感染者抗病毒治疗目前只有干扰素α和拉米夫定，所以对准种检测的需要还不十分明显，但是，阿德福韦酯、恩替卡韦等抗病毒药物已陆续在国外上市，今后还有更多的抗HBV药物陆续上市，如果医生面临多种药物，而没有选择药物的科学参考指标和原则。这样的抗病毒治疗是盲目的，水平也全是十分有限的[17-19]。
　　面对这么庞大的数字的HBV拷贝，常规的分析技术是不能有效完成HBV准种特点检测的。HBV准种检测需要高通量的分析技术。基因芯片技术可能是有希望的努力方向。将来如果临床医生能够方便获得患者血清中HBV的准种特点，又能清楚地了解不同准种的HBV对不同药物敏感性的差别，就会根据客观依据优化抗病毒治疗药物的选择和方案的制定。就会进一步提高HBV感染者抗病毒治疗的疗效。

摘自：《中华检验医学杂志》2005年6月第28卷第6期