黄正根 刘昕

　　如何实现致病菌的快速有效检测，是长期困扰临床的问题，有的细菌极难培养，如嗜肺军团菌，有的细菌生长缓慢，如结核分枝杆菌，还有麻风杆菌、炭疽杆菌等少数无法培养或者致病力很强的菌种。常见细菌用传统培养方法的检测时间大约为3~5d，临床亟待更加快速准确的检测方法。基于聚合酶链反应（PCR）扩增的基因诊断技术备受青睐，尤其是基于细菌核糖体16S小亚基（16SrDNA）的基因（16SrDNA）的分类鉴定引起了广大的科研工作者的重视。
　　一、关于16SrDAN
　　16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因。长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关[1-3]，Trand等通过对27株原核生物16SrDNA的比对发现其中至少在9个高度保守的寡聚体（oligomers）；较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称[2，4]。Woese等[3]与Olsen等[4]基于对16SrDNA的分析构建了现已被分认的全生命系统进化树，越来越多的细菌依据16SrDNA被正确分类或重分类，尤其是许多环境中的细菌[5。6]，如Funke等将棒杆菌依赖细胞毒性1组及类似棒杆菌重新确定为放线菌的一个新种，即钮氏放线菌中，Bennasar等通过比较14株施氏假单胞菌的7基因型（DNA-DNA杂交同源组），发现SP1402T（T为模式株）和SL401与施氏假单胞菌模式株明显不同，从而命名为一个新种称巴利阿里假单胞菌（Pseudomonas balearica）[2]；有的研究者还根据种内菌株间的RFLP而将各菌分为不同的核酸型（ribotype，RT）[7]。关于16SrDNA的数据库信息及分析软件较其它分类鉴定用的基因丰富得多，如RDP（http：//rdp.cme.msu.edu/html/）、ARB(http://www.ard-home.de/)、ORS(http://soul.mikro.biologie.tu-muenchen.de/ORS/)、OPD(http://www.com.msu.edu/OPD/)及PRIMROSE、CLUSTAL-X、PRIMER PREMIER、DNA START等，各分析软件因采用的算法（algorithm）不同而各有所长。
　　二、16SrDNA与致病菌的检测
　　16SrDNA的保守性使应用单一方法进行细菌的统一检测成为可能，基因诊断的灵敏度高、快速准确。尤其在苛养菌及生长缓慢的菌种的检测中具有十分明显的优势。
　　1．常规PCR检测方法：Cunha等[8]用PCR方法检测HIV-I携带者尿道拭子中的支原体，与常规培养和血清学试验作比较，认为PCR的检出率高且耗时少；Gorkiewicz等[9]通过以弯曲杆菌16SrDNA的测序结果分析，发现16SrDNA甚至可以精确地鉴定到这种水平；Yeung等[10]对商用益生菌的微物态分析也证实了这一点；Nimri利用PCR方法成功检测出临床的布鲁菌感染[11]，比血清学方法简便、快捷。Hugenholtz等[12]通过对16SrDNA的荧光原位杂交（fluorescense in situ hybridization，FISH）探针的优化设计及杂交条件的调整，认为特异性探针在适宜的杂交条件下作为病原全的检测手段是可行的； Wilck等[13]利用PCR联合测序技术成功检测出石蜡包埋的心内瓣膜赘生物国的细菌，该菌在石蜡中即可通过染色镜下检出，但是血培养却始终是阴性；Satuta等[15]基于消化性链球菌属的16SrDNA差异设计特异性引物进行多重PCR，经过两步多重PCR（two-step muptiplex PCR）能快速准确地鉴别常见的14个种；Sacchi等[16]应用巢式PCR对美国炭疽事件中的疑似病人的标本进行测序分析。证明PCR测序的快速鉴定炭疽杆菌并与其它芽孢杆菌相鉴别有效方法；李聪智等[17]设计了针对所有细菌的通用引物和针对革兰阴性及革兰阴性或革兰阳性的鉴别；其它技术如PCR-斑点杂交、PCR-反相杂交、PCR-ELISA、PCR-SSCP等应用于结核分枝杆菌各型的鉴定及临床新生儿败血症和化脓性脑膜炎的诊断[18-24]。
　　2．16SrDNA基因芯片与致病菌检测：利用16SrDNA恒定区的保守性设计通用引物，扩增全长或者部分16SrDNA序列，在可变区设计检测探针（杂交探针），用一对或几对引物就能将几乎所有细菌的相应片段扩增出来。再与固定在芯片基质上的特异性探针杂交，可以定性或者半定性检出致病菌。
　　16SrDNA联合rpoB、kasA、rpsL、gyrA等制成的基因芯片已经成功地应用于分枝杆菌的筛选鉴定及结核杆菌的耐药性筛选和分析[25-27]；李君文等[28]应用16SrDNA于4h内可以快速检测出饮用水中嗜肺军团菌、副溶血弧菌、李斯特菌、耶尔森菌、变形杆菌、绿脓假单胞菌等常见致病菌；中国军事医学科学院[29]建立了检测临床20种常见细菌的16SrDNA基因芯片模型，比较了16SrDNA克隆探针与寡核苷酸探针的杂交效率，将PCR扩增产物（907bp片段）分别与上述两种探针（荧光染料Cy5标记）杂交，结果显示：16SrDNA克隆探针具有广泛和灵敏的特点，但是交叉反应明显，寡核苷酸探针特异性强，但灵敏性稍差；Wilson等[30]应用高密度的16SrDNA芯片准确鉴定出常见17种致病菌中的15种（包括变通拟杆菌、艰难梭菌、蜂房哈夫尼菌、苏云金芽孢杆菌、唾液链球菌及肺炎支原体、立克次体等）；Peplies等[31]以大肠埃希菌（E.coli）的16SrDNA为靶序列探讨了芯片寡核苷酸探针设计有关问题及杂交条件的优化，引入了未标记的“helper”寡核苷酸观察控针二级结构对杂交的影响，同时证实了克服空间位阻的锚定链（poly ATP）的最佳长度因探针而异，探针方向对杂交效率无明显影响；Urakawa等[32]为了鉴别16SrDNA芯片杂交的单碱基错配信号，引入“DI”（discrmination index）指标及“NN”（neural network analyses）分析方法，结合优化杂交条件来鉴别单碱基错配（假阴性）。
　　Chandler等[33]构建成成一个能有效克服二级、三级结构影响的双探针体系（two-probe proximal chaperone detection system），这个体系由种特异性的捕获探针（capture probe）及与之相邻的带标记的伴护探针（labeled proximal chaperone probe）组成。前者固定在芯片基层上，可以直接捕获细菌的16SrRNA（intact rRNA），后者（生物素标记）结合在与之相邻的特异性序列上，这对探针在靶序列上相距约10个碱基的空位（spacer）；该体系既能有效地防止空间结构（base-stacking：碱基堆积）对杂交的影响，还能显著提高单碱基错配的鉴别能力。
　　Busti等[34]设计了种特异性的连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）探针（引物），其中每一对探针由鉴别寡核酸（discrimmatimg oligo）和通用探针（common probe）组成。前者的5ˊ端用荧光染料Cy3，后者的3′端连接有cZipCode（complementary ZipCode）；通用芯片（universal chip）上固定了与cZipCode互补的Zip探针，当检测到特定的细菌16SrDNA时，LDR的两探针在pfu DNA ligasa作用下连接成一条寡核苷酸探针，其5′标记有Cy3，3′端为cZipCode，则3′端再与通用芯片上相应的Zip探针杂交就能在待定位置检测到Cy3的信号，该方法能有效地分辨各菌种间16SrDAN单个碱基的差别，不足之处是仅能检出LDR探针相应的菌种。
　　为了扩大芯处至致病菌的检测谱，Bertilsson等[35]设计出一种从未知（16SrDAN）的菌种中合成特异性探针的方法。该方法针对或变区（序列未知）两侧的恒定区（各菌种相同）设计一对通用引物，其中一条引物称为可分离的引（detachableprimer），其5′末端标记上生物素，3′末端为一个核糖苷（ribonucleotide）；PCR扩增产物与链亲合素包被的磁珠（streptavidin-coated magnetic beads）结合后在85℃高温下洗脱除去一条互补链，再通过碱性水解将剩余片段与磁珠分离；再以上述洗脱下来的片段为模板，合成另一条可分离的引物对它进行每二次PCR扩增（线性扩增）；第二次PCR扩增的产物再经过上述磁珠结合，水解分离先进步骤，即可得到特异性的探针，此探针的特异性取决于该可变区（PCR扩增区）的变异程度。
　　三、问题与展望
　　16SrDAN检测致病菌虽然有快速、直接、准确等优点，但是它有一个无法克服的问题：只要有细菌的DNA碎片（死菌），检测结果就是阳性[18]，不能区别是感染状态还是恢复期；以序列比对为基础建立起来的16SrDAN基因诊断，要想成为一种临床检测的常规方法，还需要一个强大的质控序列数据库[36，37] ；而且肖的数据库还不够完善，甚至数据库的有些信息是错误的[1]；想在短短的一个或者两上可变区内（近百个碱基）找到足够多的差异信息几乎是不可能的[30]；同时，芯片杂交的重现性仍待解决，严格质量控制下的实验研究的结果与临床的广泛应用还有一定的距离；尤其是要在检测的细菌谱比较广的前提下，达到所有属间甚至种间的鉴别，以及对混合病原全（多重感染情况下）的鉴定。
　　总的说来，16SrDAN的鉴别能力在属及属以上分类单位[38]，近年的研究发现，16SrDAN与23SrDAN的间区序列（intergenic spacer，ITS或internal transcribed spacer，ITS或intergenic spacer regions，ISR）[39-41]也可以用来对细菌进行分类和鉴定，但是依据23SrDAN绘制出来的系统发育树与16SrDAN的有一定出入，而且在少数菌中16SrDAN还存在的插入突变[42]；因此，将二者结合起来进行细菌的分类和鉴定可能是以后临床诊断研究的方向。
　　如果充分利用芯片的高能量特性，结合16SrDAN-32SrDAN间区序列的相关特性[43]，设计3-5个探针指向同一种细菌。将近全长甚至超全长16SrDAN的PCR扩增产物片段化后杂交，优化杂交条件，同时联合十几种临床常见耐药基因的检测。那么，16SrDAN基因芯片用于临床感染病的快速诊断及指导性用药是完全可能实现的。

摘自：《中华检验医学杂志》2005年6月28卷第6期