李厚敏 刘伟 李若瑜

　　美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）1997年版推出了关于酵母菌的液体培养基稀释法（全量法与微量法）抗真菌药物敏感性试验方案M27-A。该方案准确性高、重复性好，实验室间结果的一致性可以与抗细菌的药物敏感试验相媲美。之后，NCCLS1998年版又提出了关于产孢丝状真菌的抗真菌药敏试验倡导方案M38-P。该方案包括微量液基稀释法与多量液体培养式稀释法，适用于曲霉菌、镰刀菌、波氏霉菌等丝状真菌，一致性限，近年来，NCCLS在该方案的判定等因素的方面进行广泛深入的多中心研究，加上新型三唑类药物的问世和临床应用的逐渐增多，于是NCCLS在2003年新版中又推出了产孢丝状真菌抗真菌药物敏感试验方案，即M38-A，简介如下。
　　一、受试真菌
　　受试真菌包括：曲霉菌属、镰刀菌、根霉菌、波氏假阿利霉菌，以及申克孢子丝菌的菌丝相；不包括双相真菌的酵母相。
　　二、抗真菌药物
　　1．来源：抗真菌药物系自生产厂家直接购买的药物粉末，不能使用药店药物或其它临床制剂；药物粉末按厂家建议储存，可存于-20℃、甚至更低温度的干燥器（最好是真空干燥器）。
　　2．抗真菌药物粉末及其溶剂的称量：应根据该药物的分析含量进行称重；计算药物质量或制备标准溶液所需溶剂体积的公式同M38-P方案。
　　3．储存液制备：抗真菌药物的储存液的深度至少为1280ug/ml，或10倍于其最高测试浓度。但有些药物因其溶解度比较低，只能配制较低浓度母液，在这种情况下，应当参考厂家提供的数据判定其溶解度。
　　非水溶剂的应用：非水溶性药物（包括原有三唑类药物、两性霉素B以及新型三唑类药物）应当用二甲亚砜（DMSO）、乙醇、聚乙二醇和羧甲基纤维素等非水溶剂进行溶解，这些药物必须以至少100倍以上的所需测试浓度进行溶解，每一种中间溶液均须用相同的稀释至所需的浓度。溶剂的终浓度必须低于1%。
　　过滤：储存液通常是无菌的；如果需要进行灭菌，可以用滤膜过滤，禁用有可能吸附抗真菌药物的滤纸、石棉或烧结玻璃滤器。
　　储存：将无菌母液小量分装至无菌聚丙烯小管，小心密封后存于-60℃或以下存放6个月或更长的时间而不丧失活性。
　　测试浓度：基于以往的研究结果，测试药物的浓度范围如下：两性霉素B，0.0313~16ug/ml;氟胞嘧啶,0.125~64ug/ml;酮康唑, 0.0313~16ug/ml;;伊曲康唑以及新型三唑类药物, 0.0313~16ug/ml;氟康唑, 0.125~64ug/ml.
　　培养基:使用RPMI-1640液体培养基(含谷氨酶胺,不含碳酸氢盐,含有酚作为pH值试剂),以终浓度为0.165mmol/L的MOPS为缓冲液,该液基在25℃时pH为7.0±0.1.
　　三、试验方法
　　1.抗真菌药物稀释液的制备:使用一次性使用的无菌96孔板进行药敏检测;对于每种受试真菌,使用不含抗真菌药物的RPMI-1640孔作为生长对照孔;首先吸取所有的稀释剂,在每一管中加入药物的储存液,顺次进行倍比稀释;因为接种的真菌菌悬液与抗真菌是终浓度的2倍,对于不溶于水的抗真菌药物,如酮康唑、两性霉素B以及伊曲康唑,应当在适当的溶剂中配制成最大终浓度的100倍,然后再用RPMI-1640稀释50倍(这样就能保证溶剂的终浓度在1%以下)
　　2.真菌接种液的制备:在多数真菌必须在35℃用土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)活化7d,镰刀菌必须在35℃孵育48~72h后,在25~28℃孵育至第7d;在孵育7d的菌落悬液静置3~5min后,大颗粒沉于底部,取上层均质液体(含孢囊孢子或分生孢子以及菌丝片段)至无菌小管,振荡15s,用分光光度计调整菌悬液浓度;曲霉菌、申克孢子丝菌A值调整至0.09~0.11(80%~82%透光率);镰刀菌、波氏假阿利霉菌以及根霉菌A值调整至0.15~0.17(68%~70%透光率);然后以RPMI-1640液体培基稀释50倍,波氏假阿利氏霉菌接种悬液应以较低的(50%)稀释倍数接种,1:50稀释后得到2倍终浓度的接种悬液,其浓度为0.4~5×104CFU/ml.接种量可以通过在沙堡弱葡萄糖琼脂培养基(SDA)上接种0.01ml1:100稀释度的菌悬液来准确计数.
　　3.孵育:所有的96孔板在35℃静置孵育;根霉菌21~26h后判读MIC.镰刀菌、曲霉菌属以及申克孢子丝菌在46~50h判读MIC,波氏假阿利霉菌在70~74h判读MIC.
　　4.结果判定:是肉眼可见的抑制真菌生长的MIC值;一般而言,读取MIC值时,应当在阅读镜的辅助之下,将每个受试孔中真菌的生和情况与生长对照孔相比较,进行评分:4分示:生长无抑制;生长轻微减少或相当于生长对照的75%;2分示:生长明显减少或相当于生长对照的50%;1分示:轻微生长或相当于生长对照的25%;0分示:肉眼观察澄清或未见生长.
两性霉素B:对于两性霉素B,MIC值判定为没有可见生长(读数为0)的最低药物浓度.若出现两性霉素B拖尾的情况,临床上可能表现为耐药.
　　氟康唑、酮康唑或氟孢嘧啶:对于唑尖如氟康唑、酮康唑,以及氟孢嘧啶 ,其MIC值判定为相当于生长对照有50%或更多的生长减少时的最你药物浓度.

　　伊曲康唑:对于伊曲康唑以及新的三唑类药物,MIC值判定为100%抑制生长,即读数为0时的最低药物浓度;这类药物对于曲霉菌属以及其它条件致病性丝状真菌出现拖尾时,可能反映在临床上为相对耐药.
　　5.大量液体培养基稀释法:用大量稀释法测试时,用RPMI-1640液基将100倍药物终浓度的储存液稀释10倍.达到终浓度的10倍,储存液的制备与上述方法相似,孢子或孢囊孢子悬液用振荡混匀15s,用培基进行1:100稀释,达到测试浓度(0.4~5×104CUF/ml).将0.1ml的10×终浓度的药液加入12mm×75mm的无菌管中,-70℃冻存,6个月以上而不出现药物降解;每管在测试当天接种0.9ml真菌稀释悬液;生长对照为0.1ml不含药物的药物稀释液加0.9ml的接种悬液.
　　上述试管在35℃静置孵育;MIC值的判读与微量液体培养基稀释法程序相同.
　　6.改良方法:用终点色法可以增强不同实验室之间伊曲康唑MIC值判定的一致性,加入2倍浓度的比色指示剂(改良刃天青)至2×浓度的标准RPMI-1640液体培养基,然后按上述程序操作,对于比色法,需观察加样孔的颜色,蓝色表示无菌生长,紫色表示部分生长;红色表示生长.唑类药物MIC值即颜色由蓝色到紫色轻,微改变时的最低药物浓度;而对于两性霉素B,MIC即为无颜色改变的(均呈蓝色)或第一孔保持蓝色时MIC.
　　7.实验室质量控制:每次试验均须进行质控菌株的检测,其目的在于监测药敏试验的准确度、精密度、所用试剂、测试条件以及仪器的情况,保证试验者的操作以及结果的准确客观.
　　包括培养基及试验用器皿的质控;每次试验、每批培养基、试验用试剂器皿均需用质控菌株或参考菌株进行测定,其MIC值应在规定范围内(表1)
　　四、评价
　　与M38-P方案相比,M38-A方案在如下几方面进行了调整:首先,受拭的抗真菌药物中增加了新型三唑类药物posaconzole、Ravuconazole 、Voriconazole,与这些药物在系统性丝状真菌感染中越来越多的应用密切相关;其次,在终点判读时,将伊曲康唑的MIC值定交为100%生长抑制,即读数为0时的最低药物浓度,其原因是伊曲康唑和其它新型的三唑类药物,与氟康唑和酮类唑不同,判读终点时不存在拖尾;第三、质控菌株在原有近平滑念株菌ATCC22019和克柔念株菌ATCC6285的基础上,增加了参考菌株黄由霉菌ATCC204304和烟曲霉菌ATCC204305;质控药物也有相应的增加.
　　M38-A方案是一个测定丝状真菌对不同抗真菌药物敏感性的标准化程序,制定该方案的目的是希望经过相同的标准化程序,使不同实验室获得的体外抗真菌药物敏感性试验结果,与体内疗效之间具有良好的一致性,尽管M38-A中的受试真菌只有曲霉属、镰刀菌、根霉菌、波氏假阿利霉菌和申克孢子丝菌的菌丝相,仍然有不少学者应用此方案所描述的试验程序,从接种量、孵育温度、孵育时间以及终点判定等方面,探计了常见皮肤癣菌[1-3]如红色毛癣菌和暗色真菌[4,5]的抗真菌药敏试验;同时也应用该程序评价了特比萘芬[6]和其它一些新型药物[3]的抗真菌活性,结果理想,拓宽了该方案的应用范围,有望建立有关红色毛癣菌和暗色真菌的抗真菌药敏试验标准化方案,更好地为临床治疗提供依据并为新药评价提供可靠的手段.

摘自:《中华检验医学杂志》2005年1月第28卷第1期