赵辉 徐英春 谢秀丽 张悦贤  王澎

　　真菌感染已成为白血病，淋巴瘤，免疫抑制，长期使用广谱抗生素，中心静脉插管，中性料细菌减少，烧伤，低体重的早产儿，高APACHE II积分，血液透析，骨髓或器官移植，胃肠道手术和机械通气待特殊人群的严重感染性疾病，过去临床对真菌感染的经验治疗主要选择三唑类和两性霉素B。但近10年真菌的种类发生了明显的变化，有高达77%的酵母菌菌血症的是非白念球菌引起的，它们对抗真菌药可以产生耐药性，酵母菌感染的治疗面临新的挑战[1，2]。因此，对威胁生命的真菌感染的患者，进行真菌药敏试验非常重要，为调查真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性，我们采用纸片法和ATB FUNGUS2两种方法测试948株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性。
　　材料与方法
　　一、菌株来源
　　从2004年1月至2005年4月北京协和医院患者临床血液、尿液、胸腹水、脑脊液和下呼吸道标本中分离出可能致病的948株真菌。见表1、2。采用ChromG A显色培养基鉴定白念株菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌，其它念株菌采用VITEK YBC卡鉴定到种的水平。
　　　　　　　　　　　　　　　表1     948株17种真菌所占百分比

　　　　　　　　　　　　　表2   6种真菌在2004年~2005年的分离情况

　　二、抗真菌药
　　氟康唑，25ug/片，未开封和纸片-20℃保存，开封后冰箱保存4周。ATB FUNGUS 2试条，含有伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶和两性霉素B。
　　三、 真菌药敏试验法
　　1． 纸片扩散法敏感试验
　　采用2003年美国国家临床试验室标准委员会（NCCLS）建议的酵母菌纸片扩散法敏感试验指南，在Mueller-Hinton（MH）琼脂中补充2%葡萄糖和0.5mg/L美蓝[3].在1L MH琼脂中,加入0.1ml美蓝(methylene blue,Merck BP 1973产品)贮存液(0.1g美蓝加20ml无菌水即为美蓝贮存液)和20g葡萄糖.高压15min,121℃灭菌,水浴至55℃倾入4mm厚平皿备用,敏感试验其它操作步骤,与标准的细菌纸片法药敏试验相似,酵母菌悬液用无菌盐水比浊至0.5号麦氏管浊度,酵母菌量约为1×106~5×106/ml
　　2.ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验  
　　ATB FUNGUS 2试条包括16对凹形杯.每一对不含任何抗真菌剂,用作阳性生长对照,另外的15对包含不同浓度的4种抗真菌剂,用于测定最小抑菌浓度(MIC).将准备好的待测酵母菌的悬液转移到培养基中,并接种到试条上.孵育后,通过肉判读凹形杯中液体的生长情况,获得MIC.试验条采用手式接种用ATB电子移液管混匀ATB F2培养基,避免产生气泡,使用ATB 电子移液管在每个凹形杯中加入135ul的ATB F2 培养基(大约3×104酵母菌/毫升或4×104酵母菌/凹形杯).将一个盖子放在试条上,把试条放入一个密闭容器或是一个装有吸潮纸的GENbox型广口瓶里,在有氧条件下35℃(±2℃)的环境中,念珠菌属要培养24小时(±2小时),新型隐球菌在培养48小时(±6小时).对念珠菌属来说,如果在生长质控指示的凹形杯中生长不充分,24小时培养后,很难或是不可能读出试条的MIC,这时要在同样的环境下再培养24小时.
　　四、 药敏指控
　　采用白念珠菌ATCC90028氟康唑可接受的抑菌环直径范围为28~39mm
　　五、 结果判读
　　1．纸片扩散法敏感试验
　　读取抑菌环直径近似到mm，在大约80%抑制区判读为测量边界。在抑菌圈边缘或内部的极微小菌落（＜20=可忽略不计，采用BIOMIC电子自动阅读系统读取抑菌环直径（mm），并自动换算出相应的最低抑菌浓度（MIC）值（mg/L）[4]，氟康唑和5-氟胞嘧啶敏感性的解释标准见表3。
　　　　表3   氟康唑和5-氟胞嘧啶纸片扩散法的抑菌环直径和相应MIC的解释标准

抗真菌药	氟康唑	氟康唑	5-氟胞嘧啶
	抑菌圈直径/mm	MIC（mg.l/l）	MIC(mg.l/l)
敏感（S）	≥19	≤8	≤8
剂量依赖性敏感（SDD）	15-18	16-32	16-32
耐药（R）	≤14	≥64	≥64

　　2.ATB FUNGUS 2 酵母菌敏感试验
　　通过肉眼判读或是使用ATB仪器自动判读来观察生长情况，为方便肉眼判读，把试条放在黑暗的背景下，对于每一个抗真菌制剂，从低浓度开始，与生长对照杯状凹比较，记录每一个杯状凹的生长得分见表4.对于两性霉素B,最小抑菌浓度(MIC)应该判断为省长完全受抑制杯的浓度(即得分为“0”的测试杯)在杯状凹外围存在一个(或几个)散在的菌落或生长迹象,应记录为1分,对于氟康唑,伊曲康唑和5-氟胞嘧啶 ,鉴定可能存在拖尾生长,最小抑菌浓度(MIC)对应的测试杯得分可以是“2”,“1”,或者”0”分,且在杯状凹外围的生长迹象应记录为”0”或”1”分.[5]
　　　　　　　　　　　　　　　　表4  凹形杯的生长与得分
 

定义	得分
和生长对照完全一样	4
比生长对照有轻微减少	3
比生长对照孔明显减少	2
没有微弱的生长	1
没有生长	0

　　六.资料分析
　　文中所得表格采用WHO耐药监测组提供的软件WHONET5.3分析所得.
　　结果
　　909株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B和5-氟胞嘧啶的药敏试验结果见表5。
菌株数＜10株的菌种未参加分析。表5显示采用纸片扩散法敏感试验结果：氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌的敏感性为23.8%~100%.采用ATB FUNGUS 2敏感性检测结果:其中热带念珠菌的MIC50为0.125~1,MIC90为0.5~1.6.
　　四种药物对白念珠菌、热带念珠菌有较高的抗菌活性，氟康唑对光滑念珠菌有较低的抗菌活性，其MIC50和MIC90范围明显高于两性霉素B和伊曲康唑，两性霉素B和伊曲康唑比氟康唑对这2种念珠菌有较高的抗菌活性，且伊曲康唑和两性霉素B对烟曲霉有较高的体外抗菌活性。 

真菌名	株数	抗真菌药	耐药 %	中介 %	敏感 %	MIC50	MIC90	MIC平 均值	MIC范围
白念株 菌	468 104 104 103 104	氟康唑* 氟康唑 伊曲康唑 两性霉素B 5-氟胞嘧啶	0 7．7     1．9	1．1 0     0	98．9 92．3     97．1	0．5 0．125 0．5 0．5	4 0．5 0．5 0．5	0．702 0．195 0．479 0．581	0．25-256 0．016-8 0．25-0．5 0．19-128
热带念 珠菌	133 15 15 15 15	氟康唑* 氟康唑 伊曲康唑 两性霉素B 5-氟胞嘧啶	0．8 6．7     0	0．8 6．7     0	98．5 86．7     100	1 0．125 0．5 0．5	16 1 0．5 0．5	1．382 0．239 0．477 0．5	0．25-128 0．125-4 0．25-0．5 0．5-0．5
光滑念 珠菌	95 27 26 26 28	氟康唑* 氟康唑 伊曲康唑 两性霉素B 5-氟胞嘧啶	12．6 7．4     0	3．2 18．5     3．6	84．2 74．1     96．4	4 0．5 0．5 0．5	32 4 0．5 0．5	4．548 0．5 0．462 0．443	0．25-512 0．125-8 0．016-1 0．032-32
克柔念 珠菌	21 1 1 1 1	氟康唑* 氟康唑