陶洪群 李向阳 杨雷 杨锦江

　　长期以来，临床上主要用细菌培养和血清学方法检测病原菌，但均不能达到快速诊断细菌感染的目的。常规PCR技术采用针对特定病原菌的特异笥引物，由于临床病原菌往往不明，需用多种不同引物和扩增程序进行PCR扩增，亦难实现快速诊断。　　　　　　　　　　PCR-SSCP技术主要用于基因突变的检测，利用该技术鉴定细菌虽有报导[1，2，3]但都限于临床菌株，未与标准菌株为对照。本研究采用细菌共有16SrRNA基因的保守区引物作为通用物，对几种常见的细菌进行PCR扩增，SSCP分析PCR产物，并以标准菌株为对照，旨在达到快速检测不同细菌的目的。
　　1． 材料和方法
　　1．1材料
　　1．1．1菌种：大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）由中国药品生物制品检定所提供，温州医学院附属二院检测科分离保存的临床株-肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌、洛菲不动杆菌。
　　1．1．2引物：引物设计参照文献[3]进行，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，经鉴定为电泳纯。

引物	序列	在16SrRNA 基因中位置	扩增片段 长度
P11P	（5ˊGAGAGAAGGTGGGGATGACGT）	1173-1192	217bp
P13P	（5ˊ-AGGCCCGGGAACGTATTCAC）	1370-1389
ER10	（5ˊ-GGCGGACGGGTGAGTAA）	103-119	255bp
ER11	（5ˊ-ACTGCTGCCTCCCGTAG）	314-357

　　1．1．3主要仪器和试剂：Beckman GS-15R离心机，Perkin Elmer DNA扩增仪，DYY-Ⅲ型稳压电泳仪为北京六一仪器厂产品，Taq DNA聚合酶、dNTPs、100bp DNA Ladder对照购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
　　1．2方法
　　1．2．1范本DNA制备：DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术报务有限公司，主要步骤如下：菌株于血平板上37℃培养过夜，挑取0.5cm大小的菌落悬浮于200ul TE中,再加入400ul裂解液,3ul蛋白酶K混匀,55℃水浴1小时,加入600ul氯仿混匀,10000转/分离心2min.吸去上清液,立即加入100ul的1.2mol/L NaCl.轻轻振荡至DNA样品完全溶解,加入3ul RNA酶A.37℃10min,再加入300ul预冷的无水乙醇,-20℃放置10min,10000转/分离心4min.吸走乙醇,用70%乙醇洗一次,倒置室温干燥10min,100ul TE溶解DNA.
　　1.2.2PCR扩增:扩增体积50ul:10×buffer( 包括Mgcl2)5ul,20mmol/L dNTPs 1ul,5U/ul Taq酶0.2ul,5ul范本DNA,各引物2.5ul,无菌去离子补足体积.扩增条件:94℃1min,56℃min72℃30s.扩增30个循环.
　　1.2.3SSCP分析:取5ulPCR产物,与等量变性上样缓冲液(5mmol/LEDTA(PH8.0),0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯氰,95%甲酰胺)混匀,99℃热变性10min后,迅速置于水浴中不停振荡10min,10ul,处理产物全部上样,于预电泳1小时的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(电泳槽置于4℃冰箱中).电泳条件:1×TBE,4℃,16Ma4h.
　　1.2.4银染:凝胶10%乙醇固定10分钟,1%硝酸作用4min,水洗2次,0.2%硝酸银(新鲜配制)染20min,水洗3次,3%碳酸钠显色10min,最后用10%醋酸终止反应.
　　2.结果
　　2.1一对引物P11P-P13P扩增产物SSCP结果:洛菲不动杆菌、金黄色葡萄球菌SSCP图谱呈多态性，与其它细菌可相互区别；另外5种细菌SSCP图谱无多态性，较难区别。
　　2．2两对引物（P11P-P13P，ER10-ER11）扩增产物SSCP结果：细菌的SSCP图谱呈多态性，单链条带数目，相对迁移率及条带之间的间距存在明显差异，各细菌之间可相互区别。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的标准菌株与临床菌株的SSCP单链条带区图谱完全一致。
　　3．讨论
　　16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对就的DAN序列，存在于所有细菌的染色体基因中，也存在于衣原体、立克次体等原核生物中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物中。16SrRNA基因高度保守，但其保守性是相对的，在保守区之间存在着9或10个变异区，保守区和可变区相交错排列，不同细菌都有不同程度的差异，可设计不同引物以所有细菌或特定细菌进行PCR检测[4]。利用PCR技术扩增16SrRNA基因，可早期判断是否存在细菌感染，进一步分析扩增产物鉴定病析菌的种属，弥补了细菌培养和血清学检测的不足，目前主要是将两条引物设计在16SrRNA基因保守区成为通用引物，首先确定是否存在感染，然后在中间的特异区中选择序列做探针进一步鉴定细菌[4，5]，除了需PCR扩增外，还要进行探针杂交，较为复杂且费用高，李雷等[6]采用细菌16SrRNA基因通用引物，分别通过半套式PCR和套式PCR对不同细菌的DNA进行扩增，以检测细菌，需要两次扩增，较复杂且产加了污染的机会，另外有学者根据16SrRNA基因设计寡核苷酸引物，再将扩增产物进行DNA测序分析[7]，序列分析非常特异和准确，但费时且费用高，临床上难以推广。
　　SSCP技术可区分由少至一个碱基的改变面导致的构型改变，主要用于检测基因突变[8，9]，不同细菌间的16SrRNA基因序列都有不同程度的差异，可采用SSCP进行分析，本实验发现利用一对引物时，有5种细菌的SSCP图谱无多态性，难以相互区别，与文献[1，2]报导的有差异，这可能与选择的引物序列不同有关，加入两对通用后，扩增出16SrRNA基因中的1173-1389bp和103-357bp区域的靶DNA序列，由于这两对引物位于有种属特异性的可变区的两侧，扩增出的PCR产物有种属特异序列，单链DNA的迁移率是序列依赖性的，故各菌的SSCP图谱呈多态笥，差异明显，且其差异与亲缘关系成正比，可能是由于亲缘关系越近，16SrRNA基因斩同源性越大，赞成单链的构象越相似。本实验还发现，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）与金黄色葡萄球菌的标准菌株和临床菌株的图谱也相同，在单链条带区前面的200-300bp之间的条带为变性不彻底的残留的双链PCR产物，理论上讲，一对引物的单链PCR产物在SSCP电泳时表现两条单链带[10]，但在本实验发现，一对引物的图谱中有的反而只有一条单链带：加入两对引物后，有的为5条甚至6条单链带。
　　本实验不需要探针，加入两对通用引物，只需一次PCR扩增，整个过程只需要十个小时左右；同种细菌的标准菌株与临床分离株的SSCP图谱完全相同，若将不同细菌的标准菌株的SSCP图谱存入数据库作为模式图谱，将临床病原菌的SSCP图谱与之比较，可简便、快速、特异、敏感地检测细菌，尤其适用于临床无菌部位如血液、脑脊液的病原菌检测。在实验过程中要注意每一环节都严格无菌操作，避免出现假阳性结果。

摘自：《临床检验及实验室设备》2005年6月第七卷第2期