刘志远 许淑珍 肠球菌是医院感染的重要病原菌［１］。对多种抗菌药产生耐药性，而且耐药菌株不断增加，接合转移是导致肠球菌庆大霉素等耐药基因转移、耐药性播散的重要原因，深入研究接合转移试验有助于了解肠球菌耐药性的产生机理，我们研究了不同培养基和不同转移方法对肠球菌质粒转移试验结果的影响，并对接合前后菌株的耐药性进行了分析。
材料和方法
一、 材料
1． 菌株
（1） 供体菌 36株高耐庆大霉素（HLGR）粪肠球菌，15株HLGR屎肠球菌，1株耐万古霉素（VER）粪肠球菌均来自北京友谊医院的临床标本，所有菌株利福平MIC值均小于32ug/ml。
（2） 受体菌 粪肠球菌JH2-2（由Don B.Clewell赠送，利福平MIC＞50ug/ml，对庆大霉素、链霉素、青霉素、万古霉素、氨苄西林、四环素、氯霉素敏感）；本实验室分离的金黄色葡萄球菌S1106（四环素MIC128ug/ml）、表皮葡萄球菌S368（利福平MIC64ug/ml）。
（3） 质控菌株 粪肠球菌ATCC29212、ATCC51299。
2． 抗菌药 庆大霉素（Gm）、链霉素（Sm）、青霉素（Pen），利福平（Rif）、万古霉素（Van）、氨苄西林（Amp）、四环素（Tet）、红霉素（Ery）、氯霉素（Chl）等标准品购自中国生物药品检定所。
3． 培养基
（1） 普通肉汤（NB）牛肉粉10g、牛肉胨10g、K2HPO4.3H2O 0.58g、NaCl5g，加水至1000ml，高压灭菌备用。
（2） 心脑浸液粉（BHI）购自公司。
4． BHI选择培养基 Gm/Rif选择培养基①：Gm500ug/ml，Rif50ug/ml；Gm/Rif选择培养基②：Gm500ug/ml，Rif32ug/ml；Gm/Tet选择培养基：Gm500ug/ml，Tet64ug/ml；Van/Rif选择培养基①：Van64ug/ml，Rif50ug/ml；Van/Rif选择培养基②：Van64ug/ml，Rif32ug/ml；Van/Tet选择培养基：Van64ug/ml，Tet64ug/ml。
5． PCR相关试剂购自赛百成盛公司、天为时代公司。PCR仪为美国Biotronic公司AG-9600型扩增仪。
6． Vitek-AMs全自动微生物系统（bioMerieux Vitek，Inc.）。
二、 方法
1． 菌株鉴定及药敏试验 全部试验菌株经Vitek全自动微生物系统鉴定，药敏试验按照NCCLS推荐Kir-by-Bauer法进行，采用2002年NCCLS推荐琼脂稀释法，进行高耐庆大霉素（MIC>500ug/ml）,高耐链霉素(MIC>2000ug/ml),耐万古霉素(MIC>6ug/ml)的确证,以及利福平的MIC测定.
2． 质粒接合转移试验
(1) 肉汤接合法 按参考文献[2]进行,将活化后的保存菌株用生理盐水和调制浊度为麦氏管0.5号,取5ul菌液于1ml中不同的液体培养基:普通肉汤(NB)、普通肉汤加马血清（NBH）、心脑浸液（BHI）、BHI加马血清（NBH）。35℃培养4h，提供体菌及受体菌各20ul、60ul按1：3混合，加入到2ml相对应的液体培养基中，35℃振荡培养4h，离心后取少量沉淀培养物转种于含抗菌药物的BHI选择培养基，48h观察结果，有菌落生长者即为接合转移成功。
(2) 滤膜接合法 按参考文献[3]进行，将活化后的保存菌株用生理盐水调制浊度为麦氏管0.5号,取5ul菌液于1ml中液体培养基35℃培养4h,取供体菌及受体菌各20ul,60ul按1:3混合,直接涂布于灭菌的无菌滤膜(孔径0.22um),将滤膜置于BHI平板中,35℃培养过夜,用1mlBHI肉汤中洗滤膜,将冲洗液转种于BHI选择培养基,48h观察结果,有菌落生长者即为接合转移成功.
3.质粒DNA的提取:采用碱性裂解法[4],裂解液I中不必加入溶菌酶,加入II液后静置时间延长到7~10min.
4.PCR法检测耐药基因 检测双功能酶基因aac(6′)-aph(2〞)的引物[5]为5′-TGA TTT TCC TTT GAT GT-3′.20ul PCR 反应体系,扩增条件:预变性94℃ 5min,变性94℃30s,退火52℃30s,迁伸72℃60s,30个循环,分别以ATCC51299和ATCC29212作为阳性和阴性对照.
结果
1. 粪肠球菌标准菌株ATCC51299,ACTT29212质控结果见表1
表1 粪肠菌标准菌株在8种抗生素培养基上的生长结果 | Gm(500 ug/ml) 培养基 | Rif(50 Ug/ml) 培养基 | Gm/Rif 选择培 养基① | Gm/Rif 选择培 养基② | Gm/Rif 选择培 养基 | Van/Rif 选择培 养基① | Van/Rif 选择培 养基② | Van/Rif 选择培 养基 | ATCC51299 | + | - | - | - | + | - | - | - | ATCC29212 | - | - | - | - | - | - | - | - |
注:“+”有菌落生长,“-”无生长
2. 质粒接合转移试验结果
(1)36株粪肠菌耐药质粒液体接合转移和滤膜接合转移试验的结果见表2
表2 36株粪肠菌质粒接合转移结果 转移方法 | 培养基 | 供体菌数目 | 结合子数目 | 转移通过率百分率(%) | 肉汤接合法 | NB | 36 | 18 | 50 | | NBH | 36 | 27 | 75 | | BHI | 36 | 32 | 89 | | BHIH | 36 | 32 | 89 | 滤膜接合法 | BHI | 36 | 36 | 100 |
注:普通肉汤(NB)、普通肉汤加马血清（NBH）、心脑浸液（BHI）、BHI加马血清（BHIH）
（2）使用BHI肉汤作为培养反应介质，15株HLGR屎肠球菌中无一株将HLGR耐药性转移至JH2-2。但通过滤膜接合法，用14株转移成功。
（3） 使用BHI培养反应介质，VRE肠球菌浆对万古霉素耐药性转移至JH2-2。
（4） 肉汤接合法、滤膜接合法均未能将HLGR、VRE的耐药性从肠球菌属转移至金黄色葡萄球菌S1106、表皮葡萄球菌S368。
3． HLGR粪肠菌的供体菌与结合子药敏试验结果见表4，表5。36株粪肠球菌均对3种以上抗菌药耐药，36%（13/36）和47%（17/36）的菌株对4种和5种以上抗菌药耐药。
4． PCR耐药基因检测 在36株粪肠球菌及14株屎肠球菌供体菌及所形成的结合子中均检测到了anc（6′）-aph（2〞）基因。
表3 HLGR供体菌株及结合子的药敏试验结果 抗菌药 | 供体菌（36株） | 结合子（36株） | 耐药菌株数 | 耐药百分率（%） | 耐经菌株数 | 耐药百分率（%） | 庆大霉素 | 36 | 100 | 36 | 100 | 链霉素 | 21 | 58 | 17 | 47 | 青霉素 | 11 | 31 | 1 | 3 | 氯霉素 | 20 | 56 | 13 | 36 | 氨苄西林 | 9 | 25 | 1 | 3 | 红霉素 | 35 | 97 | 27 | 75 | 四环素 | 29 | 81 | 28 | 78 | 合计 | 36 | 36 |
表四 36株粪肠球菌及结合子耐药谱 菌株 编号 | 转移前供体菌 | 转移后结合子 | 抗菌药 | 抗菌药 | Sm | Gm | Pen | Chl | Tet | Amp | Ery | Sm | Gm | Pen | Chl | Tet | Amp | Ery | 1 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | | R | R | | R | 2 | R | R | | R | R | | R | | R | | R | R | | R | 3 | | R | R | | | | R | | R | | | | | | 4 | R | R | | R | R | | R | | R | | R | R | | R | 5 | R | R | | R | R | | R | R | R | | | R | | R | 6 | R | R | | R | R | | R |
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