朱中元 王海波 谢勇 刘爱国

　　发现结构病已经100多年了，对其研究、控制、治疗的成功曾使人们乐观地预言本世纪末即将消灭结核病。1970年后的近20年，在美国及工业化国定结核病平均以每年6%速度下降[1]，出现了使之成为罕见病的良好趋势。但是80年代末期艾滋病（AIDS）的流生使结核病猛然复活，如今世界上有1/3的人感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis结核菌），每年有800万新结核病患者出现，300万人死于结核病[2]。我国现有结核病人约450万例，每年病死近20万人[3]。造成上述严峻形势的重要原因之一是结核病的早期快速诊断技术不理想，目前已有的结核抗体检测试剂均为未纯化的结核菌菌液抗原，存在特异性差异的问题[4，5]。我们使用基因工程表达的结核菌蛋白16和38KDa蛋白以及脂阿拉伯甘露糖（LAM）生产了抗结核分枝杆菌多种抗原的抗体检测蛋白芯片系统（简称：结核芯片系统），并进行了临床应用试验，取得较理想的快速诊断效果。报告如下。
　　材料与方法
　　1． 血清标本来源：结核病人血清由海南省农垦总局医院、武汉钢铁公司第二职工医院和海口市结核病防治提供，共226份。其中活动性肺结核（痰涂片或者细菌培养结核菌阳性）病人血清113份，慢性肺结核病人血清90份，结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、肾结核病人血清23份。正常对照血清：海南省农垦总局医院住院非结核病人血清148份，门诊健康体检者血甭469份，共617份，武汉钢铁公司总医院提供活动性结核病人血清，共130份。正常对照血清：武汉钢铁公司总医院住院非结核病人血清184份，门诊健康体检者血清549份，共733份，哈尔滨市胞科医院提供活动性肺结核病人血清104份，正常对照血清96份（均为门诊体检者血清）。
　　2． 结核菌纯化抗原：结核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）美国Mossman Associates 公司生产。批号：17AM2A9022，基因工程表达的结核菌38KDa和16kDa蛋白：由美国Fitzgerald公司提供，批号分别为：AO2061902和A00121301。
　　3． 金标记抗人IgG抗体：南京大渊生物技术工程有限公司制备。
　　4． 点样机：台湾然精密股份有限公司制造的Ezspot SR-A101型Biospot生物芯片打点机。
　　5． 点样抗原的最适工作浓度及临界值的确立：最适工作浓度确定时先将抗原稀释成不同浓度，先与结核病人血清和正常对照血清反应，再与不同浓度的金标记第二抗体反应，显色能取得最高的敏感性和特异性者为最适工作浓度的抗原点样，与一定数量的政党对照血清标本反应后，芯片识别读数仪测定其灰度值，计数抗原及标准差，均数与2倍标准差和即为临界值，各抗原与标本中的抗体、金标记二抗反应得到了灰度值大于或者等于临界值者为阳性。否则为阴性。
　　6． 蛋白芯片的制备：将上述结核菌抗原分别稀释成适当浓度，用点样机点样于硝酸纤维滤膜上，制成方阵，然后切成合适大小的小片，在滤膜的下方垫上一定的吸水材料，装上膜板，使之成图标的芯片，该系统命名为结核菌多抗原的IgG抗体芯片检测系统（简称：结核芯片系统）。实验用批号：PBT-TBO1A472672和PTB-TBO1A472961。
　　7． 结核抗体DIGFA检测试剂：上海奥普生物医药有限公司（简称：上海奥普）生产的结核TB-BOT○R试剂。生产文号：国药证字S20010032。批号：20030703。失效日期：20040515。检测方法和结果判断按试剂说明书。
　　8． 蛋白芯片阅读仪：南京大渊生物技术工程有限公司自主设计生产，型号：PBT-X2。
　　9． 芯片系统操作步骤：按照芯片作用说明书和芯片识别阅读仪说明书进行。
　　10． 数据处理：采用独立样本卡方检测判别各组间是否有显著性差异，P＜0.05即认为差异有显著性。
　　结果
　　一、 结核蛋白芯片系统的操作步骤：经过挑选不同的缓冲液、不同的离子强度、去垢剂和各种试剂的反应时间，在取得最佳敏感性、特异性 节省试剂等方面，如下工作程序可得到上述要求：A.在芯片上标记上样品编号。B.在芯片盒窗口内滴加4滴试剂A，使膜表面完全浸湿。C.待完全渗入后，室温放置一分钟，加等检血清100ul。D.待血清完全渗入后，再滴加6滴试剂B。E .等试剂B完全渗入后，滴加10滴试剂C。F.等试剂C完全渗入后，最后滴加6滴试剂D。G.反应完毕后30分钟内。将芯片放入芯片阅读系统进行分析。阴阳结果根据南京大渊生物技术工程有限公司生产的芯片识别仪器设置参数自动判别，该检测方案也作为我们向用户推荐的实验方案。
　　二、 3种抗原的最适点样浓度和胶体金使用的浓度：将结核菌的三种肮原分别稀释成不同的浓度，然后与不同的稀释倍数的胶体金的抗人免疫球蛋白反应，用以检测一定数量的结核病人和正常对照的标本，以正常对照的灰度值均数的2.1倍作为临界值,能取得最高敏感性和特异性的抗原点样浓度即为最适抗原点样浓度.发现结核菌LAM,38kDa和16kDa的最适点样浓度为:0.5mg/ml,0.2mg/ml和0.2mg/ml.胶体金的最适工作浓度为离心浓缩沉淀的1:25倍稀释液.
　　三、 结核芯片系统应用方面的评价
　　1. 结核芯片系统检测各种类型结核病人的阳性率:见表1.结核芯片检测活动型肺结核,慢性肺结核和其它结核病人的敏感性分别为80.4%(279/347),64.44%(62/90)和43.48%(12/23).检测结核病人总的敏感性为76.74%(353/460).检测正常对照血清共1446份,假阳性率为18.81%(272/1446),检测的特异性为81.70%.

　　　　　　　　　　　　　表1    结核芯片系统检测各种类结核病的阳性率比较
　　2. 结核芯片系统各种指标检测的意义:见表2.结核病人中,抗结核菌单个抗原的抗体阳性率以抗LAM的阳性率最高,为53.33%(176/330),次之为抗38kDa抗体阳性率43.63%(144/330),最低为抗16kDa抗体的阳性率40.0%(132/330).

　　　　　　　　　　　　　表2   各种结核菌抗原的抗体的阳性率
　　结核病人中,抗结核菌三种抗原的抗体均阳性的比例最高,占22.73%,抗LAM的抗体阳性率为21.21%,占第二位.抗38kDa蛋白和抗体阳性率为11.52%,占第三位.抗16kDa蛋白抗原的抗体阳性率为6.97%,占第四位.见表2.
　　3. 结核芯片检测系统检测结果与DIGFA法试剂检测结果的比较:两法同时检测共426份标本,结果见表3.DIGFA法检测结核病人标本的阳性率为68.31%(291/426),两者之间无显著性差异(X2=0.6,P>0.05).DIGFA法检测对照组的结核抗体阳性率为28.00%(240/857),该法检测的特异性为72.0%.DIGFA检测的特异性较结核芯片检测系统略低,但二者之间无显著性差异(X2=0.6,P>0.05).

　　　　　　　　　　　表3   结核芯片系统和DIGFA同时检测的比较

　　4. 结核芯片系统检测与DIGFA试剂检测的总符合率:两种方法检测结核病人标本均阳性242例,均阴性78例,合计为320例,二者检测结核病人的符合率为75.11%(320/426),两种方法同时检测对照驵标本859份,二法均阳性84例,均阴性691例,合计为775例(未列表显示).符合率为90.22%,.两法检测结核病人和对照驵共1285份标本.均阳性326例,均阴性769例,相符总数为1095例.总符合率为85.21%.见表4.

表4  结核芯片检测系统检测与DIGFA法检测的总符合率
 　　5.不同医院使用结核芯片系统检测的结果比较:共有3家医院参加中试,采用结核芯片检测结核病人和对照组的结果见表5.各组检测的阳性率之间无显著性差异(X2=0.6,P>0.05).
表5   不同医院采用结核芯片系统检测活动性结核病人的结果比较

 　　5. 不同批号的结核芯片和试剂比较:对结核芯片系统进行评价时,对多批试剂检测的敏感性和特异性进行了评价.现将其同有代表性的了两个批号的芯片及试剂检测的结果列于下表,两批试剂检测结核病人和对照组的检出率无显著差异(X2=0.6,P>0.05),见表6.

批号	检测TB 病人数	阳性率	%	对照数	阳性数	%
PBT-TB01A472672	113	90	79.7	617	98	15.9
PTB-TB01A472961	234	189	80.8	829	174	20.9
合计	347	279	80.4	1446	272	18.8

　　　　　　　表6   不同批号的芯片检测活动性结核病人的结果比较
　　讨论
　　检测结核菌抗体用于结核病的诊断一直是结核病基础研究和防治工作研究人员追求的目标.自20世纪70年代,首先使用ELISA技术检测结核菌抗体技术以来,检测结核抗体从方法学上分,可以分为ELISA法[5,6],免疫色谱法(DIGFA)[7,8]免疫胶体金渗滤法[9]。从使用的抗原分，基本上可以分为：1.未纯化的蛋白提取物或者纯化产物:如结核菌素(OT),聚合OT等[5,7].这些抗原用于检测结核菌抗体的敏感性较高.但是特异性很差,即与抗原的纯度有关,也与人群中非结核菌感染非常普遍,人群中存在交叉反应抗体有关.2.使用纯化的结核菌细胞壁多糖,最常用的是结核菌LAM[6,9,10].3.作用基因工程表达的抗原,目前已供商业使用的抗原为38kDa和16kDa蛋白[8,11].
　　TB芯片系统的基本原理是以微孔滤膜为载体,利用微阵列技术将纯化的结核菌LAM.蛋白16kD(rT-PA16)和38kD(rTPA38)等三种抗原固相于同一膜片上,并利用微孔滤膜的渗透,浓缩,凝集作用,使抗原抗体反应的同相膜上快速进行,再以免疫金作为标记物而直接在膜上显色,显色后的芯片放入芯片阅读仪,在专门软件的支持下对不同的抗原点阵的灰度值进行分析,实现报对这三种抗原和抗体进行同步检测,从而对结核菌感染情况做出诊断.
　　南京大渊生物技术工程公司研究的抗结核分枝杆菌多种抗原和IgG抗体检测蛋白芯片系统点样了3种结核菌或者结核菌复合群特异性抗原,即LAM[9,10],16kDa[11]和38kDa[8,11]蛋白等三种抗原,将这三种公认对于结核病的血清学诊断有很高价值的抗原的抗体检测作为结核病的诊断试剂,在世界上属于首创.LAM是其他分枝杆菌所具有的或者其含量远低于结核菌,人感染结核菌所后会产生针对此LAM的特异抗体.结核菌38kDa蛋白在培养液中的含量较牛分枝杆菌(M bovis)或者卡介苗(BCG)培养液的含量高出10倍以上,因此前者感染刺激机体产生的抗38kDa蛋白抗体量远高于牛分枝杆菌,其他分枝杆菌感染和卡介苗预防接种产生的抗体.16kDa蛋白也被称为MPT63或者TBP16.核酸杂交技术,免疫印记技术和抗体阻断技术表明,16kDa蛋白质存在于结核菌复合群中,在其他分枝杆菌不存在该抗原的基因,因而也不表达该抗原.而其他分枝杆菌感染不能诱导机体产生抗16kDa蛋白的抗体,在各独立实验室进行的大量的研究得出一致的结论.表明这三咱抗原的抗体检测对于结核菌感染的血甭学辅助诊断具有很高的敏感性,特异性[11].因此,从可疑患者血清中可以检测到此特异性抗体,而对结核病患者做出早期诊断.机体免疫功能的变化以及结核病感染的大规模血清流生病学调查具有很高的应用价值.
　　结核芯片系统检测抗多种结核菌抗原和抗体的敏感性为76.74%,特异性为81.70%,诊断指数为158.44%.阳性预测值和阴性预测值分别为90.8%及55.56%(表1和表3).表明该试剂符合临床诊断结核病的要求,可用结核病的血清辅助诊断.表2的数据表明,三种抗原联用,检测抗结核菌的抗体可提高检测的敏感性,而不影响特异性.
　　结核芯片系统的优点主要表现在以下几个方面:一是检测系统的性能指标优良,符合临床辅助诊断要求,二是检测速度快,病人血清健康出来后,只需5分钟就可以出报告,非常适合快速诊断需求,三是可以单人份操作,既可方便病人,又可以节约试剂,四是结果的判断采用芯片识别阅读仪,避免了人为判读时的主观误差.五是试剂稳定,不同的检测单位和不同批号的试剂检测可以获得稳定一致的结果(表5和表6).这些都表明该试剂将会对于结核病的快速辅助诊断起积极的作用.

摘自:《临床检验与实验室设备》2005年6月第7卷第2期