陶国华 曹兴建

　　T淋巴细胞是高度异质性的群体，根据发育过程中出现的分化抗原的不同，分为CD4+ T和 CD8+ T细胞，这种分类对于区分T细胞的异质性有一定的价值，但随着对T细胞功能研究的深入，人们发现，T细胞的功能主要是由其分泌的细胞因子介导的。1986年Mosmann等根据小鼠的CD4+ T细胞克隆产生细胞因子类型的不同，将CD4+ T细胞发为TH1和TH2两种类型，随后Romagnani等人证实体内出存在相应的TH1和TH2亚群[1-2]。以表达白细胞介素2（IL-2）和γ干扰素（IFN-γ）为主的TH1群细胞，可以增强杀伤细胞的细胞的毒性作用，激发迟发型超敏反应，介导细胞免疫应答；以表达IL-4、IL-5、IL-10为主的TH2型细胞，促进抗体的产生，介导体液免疫应答，机体TH1、TH2平衡失调，与肿瘤免疫逃逸。细菌、病毒等微生物感染有一定的关系，并参与变态反应性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的发生，与传统的临床检验项目不同，检测TH1、TH2相关细胞因子的意义，并不着重于辅助疾病的诊断，而更注重分析疾病发生发展的状况，为临床调整TH1、TH2失衡提供正确的治疗措施[3] 。由于目前尚无区分TH1和TH2细胞表面标志物，所以只能根据细胞亚群分泌特征性细胞因子的不同，间接检测TH1和TH2细胞的数目和功能。常用的方法列举如下。
　　1   胞外细胞因子的检测   主要检测血浆（血清）和其他本液中的细胞因子，血浆（血清）中细胞因子的测定。可确切反应细胞因子的表达状态，某些体液标本如脑脊液、滑膜组织液、支气管灌洗液、胸腹水等与特定疾病直接相关。
　　1．1 生物活性检测法  是根据某些细胞因子特定的生物学活性，应用相应的批示系统和标准品来反映待测标本中某种细胞因子的活性水平，一般以活性单位来表示，我生物学检测法一般敏感性较高，但实验同期较长，如集落形成法需10~14d；易受细胞培养中某些因素的影响，如血清、pH、药物；易受生物学活性相同或相近的其他细胞因子的影响，如检测IL-2时可受IL-4的干扰，TNF-α和TNF-β（淋巴毒素）表现出极为相似的生物学作用；易受待检样品某些细胞因子抑制物的干扰，如IL-1的活性可被IL-1受体拮抗物（IL-lra）抑制，TNF-α可被TNF-BP阻断；不能区分某些细胞因子的型和亚型，如IFN-α、β和γ，以及IFN-α中不同的亚型显示相同的生物学活性；某些指示细胞因子的敏感性不同，所获结果难于标准化，此外，某些人源的细胞因子如Hil-2对小鼠细胞起作用，但鼠源性的IL-2对人的细胞则无刺激作用，生物学检测法大致可分为增殖可增殖抑制、集落形成、直接杀伤靶细胞、保护靶细胞免受病毒攻击，趋化作用以及抗体形成法等几种。
　　1．2 免疫学测定法  基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过放射性同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。这类方法的优点是实验周期短，少受抑制物或有相似功能的其他活性因子的干扰，可区分不同型或亚型的细胞因子（如IFN），一次能检测大量标本，易标准化。与生物学活性检测方法相比，免疫学检测法在许多情况下敏感性低于前者，所得结果不表示生物学活笥，有的McAb只能识别重组的细胞因子，在检测天然的细胞因子中受到限制。免疫学检测的方法主要有RIA、ELISA、免疫荧光测定法和免疫发光测定法等，检测中的标准品十分重要，美国国立癌症研究所生物反应调整专题（BRM P NCI）与英国国立生物标准化和控制研究所（NIBSC）被定为WHO细胞因子标准品提供机构，各国可以该标准品为依据制备相应的参考标准品，结果以pg/ml或ng/ml表示，从而使资料共享[4]。
　　2   胞内细胞因子的检测  Schauer等[5] 对胞内细胞因子的测定作出综合评价，标本来源包括末梢血单个核细胞、肿瘤细胞、组织细胞等，检测方法常用免疫组化法，主要为碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP）技术[6] 和测定mRNA的荧光原位杂交技术（FISH），此外还有显微荧光法，将单个细胞用多聚甲醛固定，皂素渗透后，行间接免疫荧光染色，以及Schauer等[5]介绍的用刺激剂PMA（佛波酯）和Ionomycin刺激细胞，使细胞因子向高尔基体积聚，用BFA或Monensin阻断细胞因子向胞膜外转运，然后用流式细胞仪检测的方法，总的来说 TH1型细胞因子的检测相对容易，因为TH1型细胞能表达大量IL-2或IFN-γ，而TH2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-10的检测相对困难，主要原因是TH2型细胞在标本中的出现频率较低，所以有人建议用CD45RO+ 细胞来代替TH2的检测 [6]。 
　　2．1 酶联免疫点法（enzme-linked immunospot assay，ELISP）将抗细胞因子抗体包被反应板，加入待测T细胞，孵育一段时间后，加酶标记抗细胞因子抗体的酶作用底物，通过细胞的比色印迹法检测信号，最后通过图像扫描或专用的酶标仪进行分析。ELISPOT法引入生物素，亲合素放大系统后，灵敏度大为提高，在测定产生细胞因子阳性细胞频度方面，与流式细胞仪法相平行，但后教养可同时描述细胞性质和其他因子的产生情况，且结果更为客观，ELISPOT法一般双ELISA夹心法灵敏，因为其充分利用细胞因子在细胞分泌部位聚集浓度高的特点，并且ELISPOT法能够对每个细胞的分泌物定量[4]。
　　2．2 核酸杂交法 这是一类利用细胞因子的基因探针检测特定细胞因子基因表达的技术，绝大多数细胞因子mRNA在T细胞中只短暂存在，其存在的量与T细胞产生细胞因子的量有很好的相关性，所以，在大多数情况下，细胞内mRNA的量可以反映细胞产生细胞因子的情况，目前反有公认的细胞因子的基因均已克隆化，故能较容易地得到某一细胞因子的cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探行，利用基因探针检测细胞因子mRNA表达的方法多种多样，常使用斑点杂交、Northern blot、逆转录PCR、细胞或组织原位杂交等。实验的关键在于制备高质量的核酸探针和获得合格的待测物（提取的mRNA样品或细胞/组织标本）。核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物（如生物素、地高辛等）标记并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。根据其来源可分为cDNA探针、寡核苷酸探针和人工合成寡核苷酸探针常用于斑点杂交及Northerm blot，而RNA探针因穿透性好更适用于原位杂交。核酸探针技术的应用已经程序化，以cDNA探针为例主要包括：质粒DNA的提取；靶DNA自段的分离；靶DNA片段标记；待测样品mRNA的提取，标记cDNA探针对待检样品的杂交；放射自显影或显色分析。近年来RT-PCR检测特异性mRNA的方法广泛用于细胞因子研究领域。该法具有灵敏、快速等优点，甚至从1~10个细胞中就可检出的特异mRNA，适于科研或临床检测[4]。
　　2．3  流式细胞仪检测法   流式细胞术（flow cytkmetery，FCM）其基本原理是：用刺激剂PMA、ionomycin（离子霉素）体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制如黄能霉素（monensin）阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出增强细胞因子。这一技术的发展使得以往通过T细胞克隆方式在几个月才能回答的问题，在几个小时内就能得以解决。该技术成为单细胞水平上检测细胞因子产生的标准分析方法，尽管细胞因子标记流式细胞技术具有其他方法无可比拟的优越性，但是在操作过程中，需要对细胞进行刺激、阻断、固定、穿透和标记，任何一个环节都会影响实验结果[8]。流式细胞仪法常用检测指标为以CD4设门进行FCM分析。通过CD4+ 细胞中IFN-γ和IL-4的表达来确定TH1/ TH2细胞的百分率[9-10]。以CD3/CD8设门，用FCM检测分析TH1/ TH2细胞的表达率，结果准确可靠，操作方便快捷，是检测TH1/ TH2细胞较理想的方法[11-12]。近年来发现CD4+T细胞向不同的方向极化，细胞表面表达不同趋化因子受体（chemokine receptor），趋化因子受体CCR5主要表达于TH1细胞表面，是TH1细胞的特异性标记[14]，因此，利用针对趋化因子受体的特异性单克隆抗体来测定TH不同亚群特异笥较高，而且操作较简单。CCR5和CCR3抗体是最近开发出来的，但只能反映TH细胞数量上的变化，其与功能（细胞因子分泌）的变化不否一致，有待进一步的研究。
　　3  结语  ELISA法和生物活性法是测定的细胞因子的总量或总的活性，不能区分细胞因子的型和亚型，操作繁琐，难于标准化，ELISPOT法测定的是TH1和TH2细胞的数目与单个细胞分泌细胞因子量的差异，灵敏度较ELISA法高，核酸杂交检测法反映的是细胞因子基因的量，要获得高质量的探针和合格的标本较困难，该法更适用于科研。流式细胞仪法检测的是TH1和TH1的数目，检测速度快，但只能反映TH细胞数量上的变化，其与功能（细胞因子分泌）上的变化是否一致，有待进一步的研究。

摘自：《临床检验杂志》2005年第23卷第3期