陈东科 张秀珍 朱玲

　　卡他莫拉菌（moraxella catarrhalis，MC）为革兰阴性双球菌，原属奈瑟菌属（Neisseria catarrhalis，NC），Catlin在1970年将此菌分类为布兰汉菌属（Branhamella Cararrhalis，BC），1984年在伯杰分类细菌学手册中被列为莫拉菌属的布兰汉亚属（Subgenus Branhamella）。MC上人类上呼吸道的常居菌种，为条件致病菌，该菌可引起人类的多种感染，可累及全身[1]，国外资料显示，MC在成人下呼吸道感染及儿童肺炎、中耳炎等标本中的分离率，仅次于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌列为第三位[2，3]，因此，快速鉴定卡他莫拉菌具有重要的临床意义，我们用纸片法检测乙酰脂酶，来快速鉴定MC，并鉴定4种β-内酶胺抗生素的复方制剂及亚胺培养南/西司他丁对β-内酰胺酶阳性卡他莫拉菌的抗菌活性，现将结果报告如下。
　　材料与方法
　　一、 材料
　　１． 菌株来源：卡他莫拉菌（228株）、淋病奈瑟菌（15株）、脑膜炎奈瑟菌（3株）、奈瑟菌属（153株）、莫拉菌亚属（24株）、博德特菌属（6株）、不动杆菌属（138株）均为临床分离株。标准菌株：卡他莫拉菌9602、9707、0101为全国临检中心质控菌株，卡他莫拉菌ATCC25238、解乳糖奈瑟菌ATCC23970、淡黄色奈瑟菌ATCC14799、脑膜炎奈瑟菌ATCC13102、金黄色葡萄菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC29213为本实验室菌库保存。
　　２． 培养基：5%羊血琼脂培养基（SBA），5%兔血巧克力琼脂培养基（RChoc），5%羊血巧克力琼脂培养基（SChoc），含50ug/ml万古霉素的兔血巧克力琼脂培养基（Choc-V），淋病奈瑟菌培养基（NGA），MH培养基（MHA），5%羊血MH培养基（MHB），脑心琼脂培养基（BCA），营养琼脂培养基（NUA），中国蓝琼脂培养基（ZLA），DNA琼脂培养基均为本实验室自制。
　　３． 试剂：蛋白胨、DNA琼脂粉、MH琼脂粉、VITEK-（NHI和GNI）鉴定试卡购自生物梅里埃公司。万古霉素为美国礼来公司产品，盐酸四甲基对苯二胺、3-乙酰吲哚购自SIGMA公司，Nitrocefin购自OXOID公司（英国）。氧化酰纸片（1%盐酸四甲基对苯二胺溶液浸泡纸片后吹干备用），乙酰脂酰纸片（100mg/ml3-乙酰吲哚丙酮溶液浸泡50片纸片后吹干备用），1mol/L盐酸溶液（HC1）为本实验室配制。
　　４． 抗生素：哌拉西林（Pipenracillin，PIPC）齐鲁制药厂产品；氨苄西林（Ampicillin，AMP），华北制有限公司产品，哌拉西林/舒巴坦（PIPC/SBT）（4：1），海口杰威药物研究所有限公司产品，哌拉西林/他唑巴坦（AMP/SBT）（8：1），美国辉瑞公司产品，氨苄西林/舒巴坦（AMP/SBT）（2：1），美国辉瑞公司产品；头孢哌酮/舒巴坦（CFP/SBT）（1：1），美国辉瑞公司产品，亚胺培南/西司他丁（IPM/CST）（1：1），美国默沙东药厂产品。
　　二、 方法
　　１． 菌株分离与鉴定：将可疑标本接SBA和Choc-V琼脂平板上，置5%CO2孵箱，35℃培养24~72h，观察结果。细菌的分离培养和鉴定按操作说明[5]进行，分离到的菌株经涂片革兰染色镜检、触酶、氧化酶试验后，用VITED-（NHI和GNI）鉴定试卡鉴定到种。
　　２． 氧化酶试验：按操作说明[5]进行。
　　３． DNA酶试验：按文献[4]进行。
　　４． 乙酰脂酶试验：用无菌生理盐水将3-乙酰吲哚纸片沾湿，取待检菌落涂在纸片上，3min内出现蓝绿色为阳性反应，以卡他莫拉菌ATCC25238，全国临检中心质控菌珠9602、9707、0101作为阳性对照。
　　５． 生长指数（GI）测定：取经Rchoc平板24小时培养的卡他莫拉菌ATCC25238菌落于2ml无菌盐水中，制成0.5麦氏单位菌悬液，再用无菌盐水进行1：10连续稀释，取10-5、10-6、10-7稀释度菌液100ul分别接种在9种培养基上（Rchic、Schoc、Choc-V、SBA、MHA、MHB、BCA、NUA、ZLA），分别置普通孵箱和5%CO2孵箱各一套，于35℃孵育24，48，72，96h，计数至少10个菌落平板上的菌落数，并用游标卡尺量出菌落直径，求其均值（mm），再乘以此最高稀释度的对数即得生长指数值（GI）[6]。
　　６． β内酰胺酶试验：用无菌蒸馏水将Nitrocefin纸片沾湿，取卡他莫拉菌菌落涂在纸片上，5min内纸片变红色者判为β内酰胺酶阳性。
　　７． 抗生素敏感笥试验：根据NCCLS（National Commeittee for Clinical Laboratory Standards 1998）标准，采用琼脂平皿二倍稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），用多点接种仪定量种菌，以金黄色葡萄球蓖ATCC29213为质控菌株监测整个试验过程，质控值超出范围者，该批试验数据作废，找出原因后重复试验。
　　结果
　　１． 氯化酶试验结果：228株卡他莫拉菌、15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、24株莫拉菌、6株博特菌氧化酶均为阳性，138株不动杆菌氧化酶为阴性。
　　２． DNA酶试验结果：228株卡莫拉菌中DAN酶全为阳性，15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、24株莫拉菌、6株博德特菌、138株不动杆菌中DAN酶均为阴性，卡他莫拉菌对DAN酶的敏感性为100%，特异性为100%。
　　３． 乙酰脂酰酶试验结果：15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、153株不动杆菌中乙酰脂酰阳性114株（占82.6%）,228株卡他莫拉杆菌中乙酰酶全为阳性,卡他莫拉菌对乙酰脂酶的敏感性为100%,特异笥为75.7%,但与近缘菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟菌属、莫拉菌亚属)比较特异性为100%.
　　4. β内酰胺酰结果:228株卡他莫拉菌中β内酰胺酶阳性212株(占93.3%),24株莫拉菌亚属β内酰胺酶阳性5株(占20.8%),15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、6株博德特菌β内酰胺酰均为阴性.
　　5.不同培养基上的GI值比较:卡他莫拉菌ATCC25238在ZLA培养基上不生长;在MHA,BCA,NUA3种培养基上生长不良,分别经24,48,72,96h培养,与Rchoc琼脂培养基的GI值比较差异有显著性意义(P<0.05);卡他莫拉菌ATCC25238在Rchoc、Schoc、Choc-V、SBA、MHB5种培养基上经24,48,72,96h培养的GI值结果比较差异无明显意义(P>0.05);5%CO2环境与空气环境比较,对GI值结果影响不明显(P>0.05).结果如表1所示.
表1   卡他莫拉菌ATCC25238在不同培养基上的GI值比较

 

时间(h)

1号

2号

3号

4号

5号

6号

7号

8号

9号

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

24

GI P值

8.12

8.05 >0.05

7.84 >0.05

8.05 >0.05

8.12 >0.05

8.26 >0.05

7.98 >0.05

7.84 >0.05

7.84 >0.05

7.98 >0.05

4.55 >0.05

4.20 >0.05

2.80 >0.05

2.80 >0.05

2.80 >0.05

2.80 >0.05

48

GI P值

17.64

16.10 >0.05

16.38 >0.05

16.52 >0.05

17.50 >0.05

16.52 >0.05

17.50 >0.05

17.64 >0.05

17.64 >0.05

17.50 >0.05

12.74 >0.05

13.60 >0.05

9.94 >0.05

10.51 >0.05

11.55 >0.05

11.90

-

-

72

GI P值

29.40

26.60 >0.05

27.64 >0.05

27.30 >0.05

29.12 >0.05

28.42 >0.05

28.42 >0.05

28.14 >0.05

28.70 >0.05

28.42 >0.05

21.28 >0.05

20.86 >0.05

15.82 >0.05

15.40 >0.05

19.46 >0.05

18.90

96

GI P值

36.12

34.30 >0.05

33.95 >0.05

34.30 >0.05

33.70 >0.05

35.00 >0.05

35.00 >0.05

34.86 >0.05

35.28 >0.05

35.42 >0.05

28.42 >0.05

28.00 >0.05

21.28 >0.05

20.65 >0.05

26.60 >0.05

25.90

 
时间(h) 1号 2号 3号 4号 5号 6号 7号 8号 9号
 　　注:1号:5%羊血巧克力琼脂,3号:含50ug/ml万古霉素的兔血巧克力琼脂,4号:5%羊血琼脂,5号:5%羊血MH,6号:营养琼脂,7号:MH,8号:脑心琼脂,9号:中国蓝琼脂.A:普通孵箱,B:CO2孵箱.与Rchoc比较.
　　6. 抗生素敏感性试验结果:如表2所示,PIPC、AMP、PIPC/SBT、CFP/SBT、PIPC/TAZ、AMP/SBT、IPM/CST对卡他莫拉菌的MIC50和MIC90分别为0.5、4.0、0.06、0.5、0.06、0.125、2.0、2.0mg/L和2.0、8.0、0.25、1.0、0.25、2.0mg/L;PIPC/TAZ的MIC50和MIC90分别较单PIPC降低了8倍;AMP/SBT的MIC50和MIC90较单AMP降低了32倍和4倍.