徐明 黄烽

　　风湿病学作为一门新兴学科，在我国起步较晚，近年来提到了迅猛的发展。风湿病的实验室检查作为临床辅助诊断手段，对于疾病的早期诊断与鉴别诊断，了解病情的发生发展、治疗效果，以及判断预后均有重要的价值和意义。随着基础医学研究的深入，高新技术在检验领域中的广泛应用，风湿病实验室检查日益成为风湿病学中不可或缺的一部分，发挥着越来越重要的作用。
　　一、 自身抗体的检测
　　自身抗体是在特定的条件下机体对自身抗原产生免疫应管的产物，安是风湿病的重要血清标志，但其与疾病的相关性已获得认可，现认为，患者血清中高效价的自身抗既是风湿病的特点之一，亦是临床对疾病确诊的重要依据。
　　1． 系统性红斑狼疮中自身抗体的检测：系统性红斑狼疮（SLE）是自身免疫介导的，以免疫性炎症为突出表现的多种自身抗体和多系统受累是SLE的两上主要临床特征，目前已知，自身抗体中Sm抗体和抗双链DNA（dsDNA）抗体等对SLE有很高的特异性，分别为99%和95%；但二者敏感性昀较低。
　　近年来发现的一些自身抗体，如抗细胞膜DNA自身抗体（抗Mdna）和抗核小体抗体（AunA）等对SLE诊断较有意义。其中抗mRNA在SLE患者中敏感性为90.0%，特异性为98.8%，被认为可能是SLE的一种标记性抗体[1]。AunA是以细胞凋亡过程中释放的核小体为靶分子的自身抗体，对SLE诊断的敏感性和特异性，分别为64.2%~74.1%和97.9%~98.8。苏茵等[2]观察到，在抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、快速狼疮因子（DNP）、抗组蛋白抗体（AHA）阴性的SLE患者中，AunA在疾病诊断中可弥补其他抗体的不足，有利于SLE的诊断。AunA主要的临床意义在于客观存在出现在SLE早期，并与疾病活动性密切相关。
　　SLE常累及血液系统，主要表现为贫血、白细胞减少和血小板减少。研究发现，患者贫血的原因与抗造血祖细胞抗体、抗红细胞生物素（EPO）抗体等自身抗体的产生有关，而自身免疫因素在血小板减少中亦发挥主要作用，患者血清中存在抗磷脂抗体、抗血小板体以及抑制骨髓巨核细胞成熟因素。
　　神经精神性狼疮是SLE常见并发症，研究主为，以弥漫性的高级皮层功能障碍为表面的神经精神狼疮，多与抗神经元抗体（anti-N）、抗核糖体蛋白P抗体相关，有局灶性神经定位体征的精神神经狼疮，又右分为两种：一种伴有抗磷脂抗体阳性；另一种常有全身血管炎表现和明显病晴活动。舒慧君等[3]采用细胞ELISA方法对anti-N进行检测，认为检测脑脊液中anti-N是诊断系统性红斑狼疮中枢神经系统病变患者（CNS-SLE）敏感且特异的指标，而抗体水平与CNS-SLE病情活动相关。
　　狼疮性肾炎（LN）是SLE最常见的并发症，50%~70%的SLE病程中会出现临床肾脏受累，肾活检显示几乎所有SLE均有肾脏病理改变。LN形成与抗dsDNA、抗ssDAN、AunaA、抗gp70抗体和抗乙酰肝素硫酸盐抗体等自身抗体有关。自身抗体与其相应抗原形成免疫复合物后，沉积于肾组织、产生破坏性炎症反应。
　　研究表明，IgG型DNA抗体虽然在SLE发病机制中起直接作用，但抗体滴度与肾损伤的出现及损伤程度不平行，康向东等[4]对LN患者外周血清中阳离子dsDAN抗体进行检测，观测到，在LN患者外周血清中存在高滴度的阳离子dsDAN抗体，观察到，在LN患者外周血清中存在高滴度的阳离子dsDAN抗体，而无肾炎的SLE患者不存在这种抗体，认为阳离子dsDAN抗体与LN发病有关。
　　2． 类风湿关节炎中自身抗体的检测：类风湿关节炎（RA）是以关节滑膜有慢性炎症和血管翳形成，软骨和软骨下骨破坏，最终造成关节畸形和强直，为主要病理改变的自身免疫病。早期诊断、早期治疗是阻止RA病情发展和减少致死率的关键。
现已知，在RA患者血清中可检测到多种自身抗体，如列入RA诊断分类标准的类风湿因子（RF），以及RA相关的自身抗体，如抗RA33抗体、抗II型胶原体、抗钙蛋白酶抑素（calpastain）抗体、抗葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）抗体和抗磷脂抗体等。而RA特异性自身抗体，如抗Sa抗体、抗核周因子抗体（APF）、抗角蛋白抗体（AKA）、抗聚丝蛋白抗体（AFA）的抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）等、已用于临床的早期诊断。其中抗CCP抗体检测被认为是RA诊断的重大进展，其敏感性为46.6%，特异性为96.6%；并且，该抗体阳性的RA患者骨关节破坏程度较阴性者严重[5]。近来，Blass等[6]在RA患者血清中检测互一种以免疫球蛋白结合蛋白（BiP）为靶分子的抗体，其对RA诊断的敏感性为64%，特异性为99%，并可见于RF阴性患者，被认为是RA血甭诊断标志之一。
如何有效地应用已知的自身抗体进行血清学检查以提高RA的早期诊断率，是临床工作面临的一个课题。一些学者提出联合检测的思路。Saraux等[7]认为IgM RF（ELISA）、IgG-AKA、RF（乳胶凝集试验）联合检测是RA的最佳实验室检测方法，敏感性33%，特异性99%。2003年Vencovsky等[8]报道抗CCP、APF、AKA、RF的个别亚型（IgM RF）等自身抗体是早期RA侵蚀性疾病的诊断标志。
　　近年来，我国学者在RA血清学诊断方面亦做了许多深入细致的工作。李小峰等[9]通过检测APF、AKA及RF对大样本病历进行了研究。他们观察到，APF、AKA、RF3种抗体联合检测时，1种以上任何抗体出现时RA诊断敏感性69.83%，2种以上抗体同时出现特异性为98.19%，3种抗体联合检测时，3种抗体同时出现特异性99.86%接近100%.通过临床常规大样本检测，证实：APF、AKA、RF联合检测，可互为补充，并提高诊断的特异性，自身抗体阳性种类越多，特异性越强，对RA诊断价值更高。AKA、APF及AFA3个伉体是RA的特异性抗体，其靶抗原都是聚丝蛋白（filaggrin），曾小峰等[10]观察到，三者检测结果之间虽存在相关性，但并不完全重叠。在157份RA标本中，APF、AKA与AFA的重叠率分别为66.7%和63.2%，将三种抗体结合检测可提高RA的早期诊断率。李鸿斌等[11]将APF、AKA、抗Sa抗体和抗RA33抗体4种联合检测.观察到,4种抗体中任何两种抗体同时阳性的诊断敏感性和特异性分别是46.1%和95.1%,当其中3种或3种以上抗体阳性时,特异性可达99.6%;并且,有3种或3种以上抗体阳性的患者,常预示着病情较重和有骨质破坏.4种抗体联合检测时,可弥补RF阴性时的漏诊.
　　3.干燥综合征中自身抗体的检测:干燥综合征(SS)是一个主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病,并分为原发性(Pss)和继发性(Sss)两类,血清血检查时,可检测到多种自身抗体和高免疫球蛋白血症.
　　自身抗体中抗SS-B抗体和抗SS-A抗体已被列入SS的分类诊断标准.抗SS-B抗体被认为是SS标记性抗体,见于45%的患者,而97%抗SS-B抗体阳性患者有SS的临床表现.抗SS-A抗体是本病最常见的自身抗体,见于70%的患者,但特异性不高,其于某些特异的临床表面密切相关.SS-A抗原的蛋白成分主要包括60000及52000,在不同的自身免疫性疾病中,SS-A抗原一抗体反应存在差异.抗SSA抗体的检测方法较多,邓学新等[12]对免疫印迹法(IBT)与免疫双扩散法(ID)进行了比较.他们观察到,从兔胸腺中提取能检测针对52000多肽的抗体,而单纯的抗52000多肽抗体并不能表明即为抗SS-A抗体.因此,建议IBT检测为阳性的标本,应采用ID进一步确认.
　　近处来,在SS患者中检测到一些新的自身抗体,如抗M3抗体、α-胞衬蛋白多肽（α-fodrin）抗体等。Bacman等[13]用ILISA方法在SS患者血清中检测到抗M3抗体，发现该抗体在SS致病中发挥重要作用，它可使原已遭淋巴细胞侵润破坏的腺体组织进一步丧失分泌功能，并能造成SS患者腺体外神经调节功能的紊乱。α-胞衬蛋白是位于涎腺中一种自身抗原，何菁等[14]在SS患者血清中检测到α-胞衬蛋白多肽抗体。α-胞衬蛋白多肽抗体在Pss、sSS的阳性率分别为73%和40%，而对pSS的早期诊断具有参考意义；并且，抗体水平与患者的病情及预后有关。
　　3． 其他疾病中自身抗体的检测（1）系统性硬化症：系统性硬化症（SSc）是以皮肤和各脏器系统的炎症、血管和胶原纤维化的病损为主要表现。在SSc患者血清中可检测到多种自身抗体，如抗Scl-70、抗着丝点抗体、抗RNA聚合酶抗体、抗内皮细胞抗体、抗PM-Scl抗体是SSc标记性抗体，其他抗体与特定的临床表现及病情活动有关。
　　由于病例选取标准、检测方法以及患者种族不同，一些抗体在疾病中的分布及阳性率有很大的差异，如抗Ku抗体原对抗Ku抗体进行了检测。观察到，该抗体在系统性硬化症并多发性肌炎（SSc-PM）的敏感性为60.0%，特异性为99.4%，认为抗Ku抗体为SSc-PM有较高特异性。（2）炎性肌病：炎性肌病包括多肌炎/皮肌炎（PM/DM）、包涵体肌炎（IBM）等，临床表现以对称性肢带肌、颈肌和咽肌无力为特征。炎性肌病患者血清中可检测到多种自身抗体，其中抗Jo-1抗体被认为是PM/DM标记性抗体，其中在PM和DM的阳性率分别以61.4%和17.4%。
　　近来，张国清等[16]用自制的Mi-2抗原进行了抗Mi-2抗体检测。观察到，抗Mi-2抗体在DM和PM的阳性率分别为26.1%和4.5%，而该抗体对DM的特异性为99.4%。对DM而言，抗Mi-2抗体阳性组多以V型或“披肩”型皮诊等皮肤损害为首发表现，而阴性级常以肌肉症状首发。因此，抗Mi-2抗体是一种对DM诊断较为特异的自身抗体。因此，抗Mi-2抗体是一种对DM诊断较为特异的自身抗体，该抗体阳性病例组可能是DM的一种亚型。（3）抗磷脂综合征：抗磷脂综合征（APS）是以动脉、静脉血栓形成、习惯性流产和血小板减少等症状为表现的自身免疫病，患者血清中可检测到狼疮抗凝物（LA）、抗心磷脂抗体（Acl）和抗β2-GPI抗体等，其中LA、aCL已被列入APS的分类诊断标准。LA对动脉和（或）静脉栓塞的敏感性和特异性分别为8.5%~14%和98%~100%；而aCL与血栓形成密切相关。抗β2-GPI抗体具有LA活性，与血栓相关性比aCL强。
　　aCL现用ELISA方法检测,而不同厂商的检测试剂盒符合率较低.在24个欧洲实验室参与的多中心调查中,只有6个实验室10个血清样品IgG aCL测定值间完全一致[17].裴瑾等[18]对影响aCL检测的因素进行了分析.认为抗原包被、缓冲液离子强度、封闭液、反应温度以及受检样本的稀释度均可影响检测结果。（4）风湿热：风湿热（RF）是咽喉部A组β溶血性链球菌（GAS）感染后引起的一种自身免疫性疾病。脂磷壁酸（LTA）是GAS上带负电荷与膜相关的多聚体。黄建林等[19]从GAS提取LTA为抗原，采用ELISA方法对LTA抗体进行检测。观察到，风湿性心肌炎组LTA IgG抗体水平明显增高；在进一步研究中，他们发现LTA与人心瓣膜之间存在交叉抗原[20]。因此。认为LTA抗体的检测对判断RF和风湿性心脏病病情活动有重要的临床意义。（5）强直性脊柱炎：强直性脊柱炎（AS）是一种慢性进行性疾病，主要侵犯骶髂关节、脊柱骨突，脊柱旁软组织及外周关节，并可伴发关节外表现。研究发现，AS特片性关节炎常在肠道或泌尿生殖道的细菌感染后出现。Ahmadi等[21]观察到，抗肺炎克雷白杆菌抗体与AS患者的肠道损害密切相关，我国学者亦有类似观察报道。
　　二、 细胞因子的检测
　　细胞因子是一尖由各种免疫细胞和非免疫细胞产生的具有生物活性的我肽或糖蛋白，细胞因子种类繁多，其生物学作用亦广泛而复杂。近年的研究认为，细胞因子在风湿病发生发展中的作用是多方面的，这体现在不同的细胞因子参与不同的疾病过程， 同种细胞因子在不同疾病中作用亦不尽相同，细胞因子的测定对于提示风湿病的发病机制以及对疾病的辅助诊断和疗效观察有重要的指导价值。
　　1． 狼疮性肾炎中细胞因子的检测；LN发生和发展过程中有多种细胞因子及其受体参与，现认为，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是LN炎性细胞浸润肾脏的信号，MCP-1α和巨噬细胞炎性蛋白-1（MIP-1）能促进肾小球新月体形成的肾间质损害。而IL-8、IL-13、IL-17、IL-18和激湃正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）等细胞因子在活动期LN患者的肾组织、血浆和尿液中水平显著增加，并与LN肾组织病理损害程度、病变活动性相关，可作为判断狼疮疾病活动的参考指标[22-24]。
　　2． 类风湿关节炎中细胞因子的检测：炎性细胞关节浸润和血管翳形成是RA病理改变的重要组成部分。研究发现，血管内皮生长因子（VEGF）在RA滑膜血管翳的形成过程中起关键作用，它直接促进滑膜组织新血管形成，增强血管通透性，不同病期RA患者血清及关节滑液中VEGF水平可直接反映疾病的活动程度[25]。
　　3． 干燥综合征中细胞因子的检测：在SS唇腺活检组织中有炎性细胞聚集，面趋化因子的梯度分布可使炎性细胞的迁移具有方向性。研究发现，SS患者腺泡和炎症腺管可表达许多趋化因子，如BCA-1、SDF-1等，在募集T、B淋巴细胞至炎症部位中发挥关键作用。王芳等[26]观察到，在SS患者中RANTES mRNA表达水平显著增高，表达量与唇腺淋巴细胞浸润灶数及血清γ球蛋白水平呈正相关，并与病情活动密切相关。
　　4． 强直性脊柱炎中细胞因子的检测：AS主要侵犯中轴骨骼，以骶髂关节炎为标志。Braun等[27]观察到，在AS患者的骶髂关节部位有明显的T细胞浸润和TNF-α及TGF-βmRNA表达水平的升高。朱剑等[28]对AS外周血中CD4+和CD8+T细胞分泌细胞因子的情况进行了检测。观察到，患者外周血中IFN-γ水平显著升高，而IL-4无明显变化；Th1细胞在受刺激后分泌细胞因子的能力比Th2细胞低。他们认为，AS患者外周血淋巴细胞中，以Th1细胞为主，而Th1细胞分化能力较Th2细胞降低，在AS患者的关节液及关节滑膜细胞中存在MCP-1、ICAM-1和integrin β1的高表达。提示这些细胞因子在炎症细胞向关节的归巢以及关节局部的炎症反应中可能发挥重要的作用[29，30]。
需指出的是，机体内细胞因子是一个高度复杂的网络系统，不同的细胞因子其功能既有特殊性，又有重叠性、协同性与拮抗性。风湿病是一类发病原因尚不明确的异质性疾病，虽性病机制不同但有时可激湃相同的细胞群，产生相同的细胞因子谱的变化。此外，风湿病患者常伴有其他病理改变，而这些因素亦会影响体内细胞因子谱的表达。因此，全面认识和分析细胞因子在风湿病中的作用，在检测时选择合适的测定标本进行多种细胞因子同时检测可能更有意义。
　　三、 其他免疫学诊断指标
　　1． 免疫球蛋白糖基化的改变：随着糖免疫学的发展，人们发现血甭中IgG分子分为IgG2、IgG1和IgG0三种糖形。Watson等[31]对风湿病患者血清中IgG分子糖链结构进行分析，发现不同类型患者糖链结构不同。SLE和AS均具有典型的双半乳糖结构，即IgG2型；银屑病性关节炎以单半乳糖结构IgG1型为主；RA患者具有显著的去半乳糖结构，即IgG0型；干燥综合征主要是果糖结构的改变。因此，IgG分子糖链结构的研究在风湿病鉴别诊断中具有重要意义。张文利等[32]证实，IgG0型在RA诊断及鉴别诊断中具有重要价值，并可判断疾病的活动程度。
　　2． 基质金属蛋白酶的检测：RA患者常有软骨破坏，但目前尚无反映软骨及骨破坏程度的实验室指标。基质金属蛋白酶（MMPs）能直接降解软骨的骨质对关节产生破坏，被认为是一咱重要的致病因素。研究发现，MMP-3可导致软骨降解，其水平与RA患者受累关节数目、X线分期严重程度及ESR呈正相关。而且MMP-3不仅可反映病情活动，其在血清浓度的增高提示已有关节软骨破坏[33]。骨关节炎（OA）的病理特征为关节软骨进行性变性和破坏，管剑龙等[34]用酶谱法分析对OA患者血清及滑液中MMP-9活性进行了分析，认为MMP-9可能是反映关节局部炎症的标志物，并与关节软骨破坏程度相关。
　　3． 尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体的检测：尿激酶型纤溶酶原活物（uPA）是一种丝氨蛋白酶，它不仅激活纤溶酶原、基质金属蛋白酶的活性，而且能直接降解细胞外基质和基底膜。Pap等[35]观察到，uPA在OA关节软骨破坏严重的表浅层高表达。并且蛋白表达水平与关切软骨破坏程度密切相关，可作为评估病情的指标。杨春花等[36]观察到，uPA及其受体在RA滑膜组织中的表达水平明显高于OA，其中RA滑膜衬里细胞呈明显的强阳性表达；并且，RA滑膜组织中的uPA与其受体的表达具有良好的协同性，其中增强滑膜细胞以软骨的破坏。在随后的研究中，他们发现RA滑液和血浆中uPA及其受体的表达水平可作为反映患者病情活动的有效指标[37]。
　　四、 尿液分析
　　风湿病患者常常伴有肾损害。现研究认为，LN患者不仅有肾小球损害，还有管的损害；并且肾小管间质损害程度与LN肾功能恶化速度及远期预后关系较肾小球损害更加密切。因此，能敏感反映肾小管损害的检测指标，对SLE早期肾损害的诊断更有意义。近来发现，尿视黄醇结合蛋白（RBP）及α1-微球蛋白（α1-MG）能反映早期SLE患者肾小管间质功能损害，可作为临床监测的可靠指标[38，39]。周惠琼等[40]用ELISA方法检测SLE患者尿白蛋白。观察到，在肾损害时尿白蛋白比24h尿总蛋白更早出现异常。并认为SLE患者尿常规及24h尿总蛋白均正常的情况下，加做尿白蛋白测定可发现早期肾损害。
　　五、 问题与展望
　　现阶段风湿病实验室诊断中，所用的许多检测技术自动化程度不高，大部份操作程序尚需手工完成，以实验人员的技术经验的一定的要求。尤其，应用间接免疫荧光法（IIF）检测自身抗体时，荧光模型的判读以及抗体效价的判读均受实验者主观因素影响较大。诊断义试剂盒的应用虽为临床工作带来了极大的便利，但由于国家尚未制定统一的质量标准和管理办法，造成各厂商产品以及不同批次试剂之间存在的质量差异。而免疫学技术方法种类多样，不同方法的检查结果在敏感性和特异性方面亦存在差异。由于上述诸多原因。造成国内实验室间检测结果的准确性、可靠性及可比性难以保证。因此，如何有将地开展室间质量评估，加强室内质量控制，从而强化实验室质量管理体系是风湿病实验诊断中的一个急需解决的问题。此外，在风湿病实验室检测的血清学指标中，文献报道的一些自身抗体由于病例选取标准、检测方法以及患者种族不同，在疾病中的分布及阳性率有很大差异。因此，如何在国内实验室对自身抗体等血清学指标进行大样本、多中心分析，从而得出针对我国患者更准确、更合理的结论，亦是实验室诊断工作中一亟解决的问题。
　　风湿病是一类异质性疾病，各种疾病的不同亚型以及患者的病程、治疗情况、脏器受累范围和程度等均可影响检测结果；自身抗体研究中发现，即使同一抗体所针对靶抗原和表位不同，所导致的临床症状亦有差异[41]。因此，查找疾病特异性血清标志，探询疾病发病机制，是将实验室诊断研究的方向。随着分子诊断学技术的突破，功能基因组学和蛋白组学研究的深入，免疫学技术水平的成熟和完善，计算机网络技术的广泛应用以及实验室质量保证系统的全面实施，风湿病实验室诊断必将迎不全新的发展机遇，并将为临床诊断和治疗水平的提高做出更大的贡献。

　　　　　　　　　　　　　　摘自：《中华检验医学杂志》2004年12月第27卷第12期