魏来

　　随着人们对肝炎病毒感染疾病意义的认识不断加深，临床抗病毒药物研发也在不断发展，同时快速发展的分子生物学及相关技术促进了对乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）临床检测的发展。
　　一、免疫学检测的进展
　　1．HBV感染血清学标志的检测：HBV感染血清学标志检测的进展主要集中在微粒子酶免疫分析技术和HBV核心抗原的检测。
　　国内有学者以微粒子酶免疫分析技术测定8089例非肝炎病区住院患者血清HBsAg及其抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc，并结合中和试验确定浓度在5ug/L以下的HBsAg阳性816例，HBsAg浓度在5ug/L以下的HBsAg阳性数，共检出HBsAg阳性816例，HBsAg浓度在5ug/L以下的有189例，占总当选的2.34%,占HBsAg阳性人群的23.16%.其中HBsAg浓度在1ug/L以下的有84例(44.40%);1~2ug/L的有33例(17.15%);2~5ug/L的有72例(38.10%)[1].提示低水平血清HBsAg人群不容忽视.洪国强等以毕赤酵母表达HBV的S基因,表达产物与正常人血清无交叉反应,用纯化产物作包被抗原,对卫生部临床检验中心质量控品检测,灵敏度达10mIU/ml,特异性达100%,重复性良好[2].
　　日本建立一个新的HBV核心抗原(HBcAg)的检测方法,测定范围2~105pg/ml,在抗HBc高浓度时检测受抑制(＞1pg/ml,相当于80S/Co).临床血清分析表明HBcAg含量与HBV DNA相平行.但拉米夫治疗后HBV快速下降而HBcAg变化不明显,呈缓慢逐渐下降[3].
　　2.BCV核心抗原检测:1pg HCV总抗原相当于8000 IU的HCV RNA,在不同病人间检测结果略有差异,当HCV RNA低于2×104IU/ml时,现行HCV总抗原检测试剂不能检测到HCV抗原,将限制其临床应用,HCV核心抗原检测对于早期病毒血症的检测是敏感的,但在抗病毒治疗监测中不适宜用于病毒清除的实时检测[4].
　　3.抗-HCV、评价与报告方法：按照美国疾病控制中心2003年新的HCV抗体报告的实验检测导则[5]，抗-HCV仅仅在重复检测S/CO≥3.8时才可能是真正的抗-HCV阳性,而对于抗体S/CO低于3.8者应该以免疫印迹试验不确认EIA检测的抗-HCV.国内有关单位在国际科技攻资助下进行了不同区抗原的EIA试剂研制,发现不同区抗原片段抗体的检出率差异较大,以NS3和核心区抗体检出率最高[6].该检测试剂在一定程度上可以完成免疫印迹类似的工作.该部分的进展部体表现为抗原质量的不断提高,检测试剂敏感性进一步增加,在以聚合酶链反应检测病毒基因作为现症感染标志的情况下,对病毒现症免疫标志的检测进展较大,有可能在不久的将来在一定程度上替代病毒基因的检测.
　　二、肝炎病毒基因检测试剂的改进
　　与捕获杂交DNA测定(Digene),VERSANR1.0(bDNA)和COBAS AMPLICOR三种检测方法相比,Bdan3.0具有高度的特异性(99.3%),极佳的右重复性(批间CV1.6%~9.4%;批间CV6.5%~20.7%)和较宽的线性范围(2.0×103~1.0×108)拷贝/ml并且Bdna3.0与上述三种检测有良好的相关性,名检测间最大的差异在于高水平HBV DNA样本,特别是接近线性范围高界的样本[7].国内有学者建立串联重复序列信号放大液相杂交检测HBV DNA技术,利用12个串联重复的二级放大探针提高检测的敏感性,使敏感性达8.33×104拷贝/ml[8].该方法优点是利用了信号放大而不是基因扩增,然而,和早期的bDNA相似,在敏感性上还有许多待改进的地方.
　　用于HCV RNA检测的VERSANT HCV RNA3.0(bDNA3.0)较以往试剂也有了较大的改进[9],具有极佳的可重复性.线性范围和敏感性,对血清、EDTA、ACD-A抗凝血浆均有一致的结果,线性范围为615~7.69×106IU/ml,不同基因型的比较显示,最大的差异在于基因1型与非基因1型间,约1.5倍.除了样本中高胆线素(非结合胆红素≥20mg/dl)和高蛋白血症(总蛋白≥90g/L)外,其他内源性和外源性因素对于HCV阳性和阴性样本的检测均无干扰,宁明哲等以铕标记基因探针建立微孔板荧光半定量检测丙型肝炎病毒RNA的方法,线性范围可达102~106cDNA拷贝,44份丙型肝炎病人血清和20份正常人血清检测的敏感性和特异性均达到100% [10].
　　世界卫生组织(WHO)近处建立了国际标准以IU来反映HCB RNA的量,从而便于HCV RNA定量检测的全球标准化[11].HCV RNA定量检测的敏感性低于这性检测,最低检测阈值为25~615IU/ml.线性检测范围的上限5×105~7.7×106IU/ml.对于超过检测线形范围上限的样本应该稀释10~100倍后再检测,方能获得准确定量.定量检测的特异性为98%~99%,不受基因型的影响.
　　三、肝炎病毒基因型的检测及乙型肝炎病毒变异的检测
　　泰国一个研究小组设计了同时这亘检测HBV和HBV基因型的实时PCR体系[12]在一步扩增中以融解曲线来定量和判断基因型,准确必来92.31%,而作为对照的PCR-限制性酶切长度为多态性分析的准确性仅仅为90.38%,特别适合HBV基因B型和C型流行区大规模样本的检测.
　　许军等根据对GenBank中31条HBV基因的比较,发现HBV基因型B在核苷酸(nt)321位是A,nt324位是T,nt345位是G,nt408位是G;并对所测定的18条不同地区的HBV基因序列进行分子进行分析,结果一致,表明这些位点特异的核苷酸可以简化序列分析后的工作[13].朱冰等依赖Ava II和Mbo I两个限制性内切酶平行酶切,建立聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术快速完成乙型肝炎病毒基因B型和C型的分型[14].黄晶等利用Ava II和Dpn II两个限制性内切酶以巢式聚全酶链反应产物进行平行酶切,即可分辨A-G7个HBV基因型[15].
　　随着拉米夫定的广泛应用,建立一系列耐拉米夫定的HBV YMDD基因序列4个突变位点检测方法,包括基因芯片和实时荧光聚合酶链反应技术,前者与序列分析相比较,检测50份拉米夫定治疗血清的符合率为98%,自身的重复率为96%~100%,既可检测单一突变也可检测多位点突变[16],后者依靠寡核苷酸探针与模板结合时不匹配碱基显著影响熔解温度的原理检测了354份标本[17].而对于YMDD变异的整体研究.黄燕萍待应用单链构象多态性和异源双链分析观察拉米夫定治疗前后慢性乙型肝炎患者HBV准种的变化[18],发现治疗前准种较复杂;特别是根据优势克隆序列分析发现,6例患者在治疗后有5例在不同位点出现变异,认为该方法避免其他检测方法的片面性.
　　四、核酸检测样本制备的标准化
　　核酸制备的标准化主要依赖磁珠\离子交换和硫氰酸胍-硅技术.MagNA主要依赖于磁珠对核酸的分离作用[19],使检测敏感性达200拷贝/ml,线性范围达8个对数单位.其他核酸纯化体系包括Chemagic DNA/RNA[20]和COBAS AMPLIPREP提取HBV DNA[21].
将MagNA也可用于HCV RNA的提取[22],自动核酸提取后COBAS HCV2.0检测的敏感性达251IU/ml(95%可信限86.8~99.9).AmpliCap/GT-12是以磁珠分离加探针捕获纯化HCV RNA的方法,所提取核酸后的检测范围达500~8.5×105IU/ml[23],能去除手式纯化不能去除,以聚合酶链反应有干扰的低浓度硫酸右旋糖酐(1 mmol/L).
　　NucliSens是基于硫氰酸胍-硅技术的自动核酸纯化系统[24],因为使用硫氰酸胍,将样本于80℃孵育10min与37℃孵育30min的效果一致,但在室温下孵育或者以蛋白酶K预处理的提取效率更低一些.
　　国内程正江等[25]将待测务核酸提取液混合\离心煮沸后直接进行聚合酶链反应,简化了核酸的提取,检测的精确度达95.96%,而DNA提取后的检测精确性为92.33%.另一个研究者比较了直接煮沸裂解法、NP-40煮沸裂解法、沉淀煮沸裂解法和磁珠核酸提取乙型肝炎血清标本和含不同肝素的血清DNA模板，发现磁珠酸提取法的提取效率高，抗干扰能力最强[26]。
　　可见聚合酸链反应检测中的核酸提取已经引起国内学者的重视，并不断接近可标准化的方法，但还有一段距离，还需要及时跟上国际的潮流，以尽早达到标准化。
　　五、质量控制
　　质量控制正越来越引起人们地重视，由于HBsAg是目前临床上检测最频繁的指标，卫生部临床检测中心评价了409家医院和207家血站实验室的HBsAg检测质量控制，发现未使用室内质控血清实验室的测定总错误率竟然高达73.6%，其中弱阳性标本的测定错误率最同，达68.8%,即便使用了室内质控血清,弱阳性标本测定的错误率仍达35.2%[27].因此,在HBsAg实验室检测中必须使用室内质控血清,而且必须采用弱阳性质控血清进行严格的室内质控.
　　针对目前国内普遍使用PCR检测HBV DNA,所使用的定量标准不一致且都有是cDNA或质粒DNA的问题,王露楠等将HBV DNA强阳性血清以阴性人血清1:5倍比稀释冻二组成定值标准系列血清,制备剂量反应标准曲线.经过COBAS AMPLICOR HBV MONITOR、上海申友、深圳匹基、洛阳美和中山达安等试剂验证,线性回归系数均在0.99以上,检测结果在103~106拷贝/ml间的变异均明显降低,从而克服因试剂盒提取方法不同所带来提取效率问题导致的结果不致[28].
　　法国对12个实验室检测HCV RNA的质量控制进行分析,发现符合率自53.3%~100%不等,核酸提取前未离心以检测结果的影响最大[29].

摘自：《中华检验医学杂志》2005年6月第28卷第6期